益生菌黏附能力评估模型的研究进展

吴振超， 高永生， 王 森， 王秋举， 雷新雨， 张东鸣3，*， 陈玉珂*

(1.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；3.通化师范学院，吉林 通化 134000)

随着“无抗”养殖的大力发展，抗生素的替代研究越来越受到研究者的重视。其中，益生菌作为抗生素的替代品在养殖领域取得了瞩目的成就，且具有广阔的发展前景[1]。益生菌，也称益生素，是一类具有调节宿主肠道与肠道菌群之间生态平衡作用的活性微生物[2]。大量的国内外研究发现，益生菌具有抑制有害菌的生长和强化宿主肠道黏膜屏障等作用[3]。动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、放线菌(Actinomycesbovis)、酵母菌(Yeast)等几大类。而在畜牧业生产中应用的益生菌主要有：芽胞杆菌(Bacillus)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、酵母菌等，它们主要来自畜禽的肠道或其生长环境中[4]。研究者发现益生菌在宿主肠道的黏附作用具有特异性，因此非同源的益生菌在养殖生产中的应用效果并不理想[5]。目前，益生菌的应用面临的主要问题是可应用的菌种少和菌种黏附性差。所以筛选黏附性高的菌种是益生菌开发应用的关键。研究表明，益生菌进入动物的肠道后会逐渐形成稳定的菌群，进而发挥营养、免疫和代谢等作用[6]。益生菌只有在宿主肠道中稳定定殖，才可以进行菌群繁殖，进而发挥自身的益生功效。而益生菌的黏附能力是其在宿主肠道中定殖的关键因素，也是益生菌质量检测和筛选的重要标准。因此，益生菌黏附能力评估模型的建立是益生菌开发过程中最基础和最关键的技术环节。目前，常用的益生菌黏附能力评估模型都具有一定的局限性，并不能够准确地反映益生菌在宿主肠道中真实的黏附状态，对于肠道益生菌黏附能力的检测尚未建立精确、经济高效、省时省力的理想模型。因此通过进一步对益生菌在肠道中黏附机制的研究，结合宿主肠道内的真实环境，构建稳定高效的益生菌黏附能力评估模型是解决养殖业中益生菌菌种少和黏附能力差等问题的关键。

1 益生菌黏附能力的评估模型

近几年来，在微生物领域应用最广泛的黏附能力评估模型有体外细胞黏附模型、体外黏液黏附模型、体外肠组织模型和体内黏附模型。但由于体外模型与真实的肠道环境相差较大，很难准确地评价菌株的黏附能力，通常需要与体内黏附模型相结合来进行试验检测。目前，有大量的国内外学者通过对益生菌在宿主肠道中的黏附机制进行研究，建立了多种益生菌黏附能力评估模型，以下是近几年益生菌黏附能力评估模型的研究进展。

1.1 体外细胞黏附模型

体外细胞黏附模型是通过体外培养肠上皮细胞来检测益生菌菌株黏附能力的方法，也是使用最广泛的一种黏附能力检测手段。目前主要有以CaCo-2、HT-29、IEC和IPEC-J2等细胞系建立的模型。大量的研究证实，体外细胞模型能够简单、快速、直观有效地检测益生菌的黏附能力[7-11]。Gopal等[12]通过CaCo-2、HT-29以及HT29-MTX的细胞模型检测了双歧杆菌和乳杆菌的黏附能力。Gagnon等[13]通过CaCo-2细胞黏附模型从人粪便中分离出黏附性强的双歧杆菌。Larsen等[14]通过运用IPEC-J2细胞系研究了钙离子对乳酸杆菌的黏附状态及对大肠埃希菌(Escherichiacoli)抑制的影响。Huang等[15]利用C2BBe1细胞株建立了乳酸菌益生菌肠道黏附的体外模型，并就嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的黏附性与CaCo-2细胞模型进行了对比，证明C2BBe1可作为CaCo-2的替代物来评价益生菌菌株的体外黏附特性。

体外细胞黏附模型虽然具有直观有效的特点，但在应用过程中，此模型却忽略了细菌在宿主肠道内黏附时的真实环境。宿主肠道的上皮细胞表面还覆盖一层黏液保护层，黏液层主要由糖脂、高度糖基化的大分子蛋白或黏蛋白组成，是细菌黏附定殖的主要位置[16]。肠道上皮细胞会持续更新，黏液不断分泌，所以在细菌与肠上皮细胞未接触之前，已经被退化的黏液和肠道内容物从黏液表面清除掉，因此通过体外细胞模型仅仅可以判断大部分益生菌暂时的黏附能力。Schijrin等[17]发现乳双歧杆菌(Bifidobacterium.Lactis)对肠细胞系CaCo-2黏附较差，而Kirjavainen等[18]试验证明，乳双歧杆菌对肠黏液黏附能力较高，这说明在肠黏液上具有高黏附性的菌株，并不能与肠道上皮细胞达到良好的黏附效果。所以组织培养肠上皮细胞并不能真实有效地检验益生菌的黏附性，需要建立一种更准确的新型模型为益生菌黏附性试验提供方法。

1.2 体外黏液(黏液蛋白)黏附模型

由于体外黏液黏附模型中所应用的黏液蛋白多数直接来自宿主的肠道内，因此通过体外的黏附试验，根据菌株在宿主体内的定殖情况，可以直接判断宿主肠道中益生菌黏附受体是否存在。但是由于动物肠道中有多种细菌存在，而不同细菌之间存在空间位点和营养竞争的情况。即使在同一种微生态环境中，也存在两种或两种以上的微生物对同一黏附位点或者肠上皮细胞及其生长所必需的营养物质进行竞争的情况[29-31]。所以黏液蛋白的应用只是考虑了黏液蛋白的来源，而忽略了益生菌在宿主体内定殖时的真实环境，具有一定的局限性[32]。

1.3 体外肠组织模型

体外肠组织模型是通过动物肠组织分离进行体外培养而建立的模型，它更接近于动物体内的真实环境，因此，在实际应用中常结合免疫组化和荧光标记等技术来检测益生菌在肠组织中的定殖情况，也更能准确地检测到在肠道组织的影响下益生菌的黏附作用。Saremdamerdji 等[33]通过对离体的肠组织进行体外培养，采用活菌计数法检测了益生菌与肠黏膜之间的黏附性能。王斌[34]结合免疫组化技术在小鼠体外肠组织模型中检测了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)的黏附性，并成功筛选到高黏附性的乳杆菌。Vesterlund 等[35]运用肠组织模型采用荧光标记技术研究了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusbrhamnosus)GG株的黏附能力以及其对伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的黏附抑制特征。虽然体外肠组织模型能够更好地模拟体内真实环境，但也存在很多缺点。例如，培养的条件较为复杂，组织在体外的存活时间较短，实验过程中成本较高，且荧光染料可能在与益生菌接触过程中改变菌体的表面结构，对其黏附性产生一定的影响等[36-38]。

1.4 黏附抑制模型

黏附抑制模型一般分为拮抗抑制、置换抑制和竞争抑制三种形式。黏附抑制模型用来评定益生菌对致病菌的黏附抑制强弱，并且可以由此建立防止感染的新方法[39]。刘文玉[40]通过拮抗抑菌实验，筛选出两株具有高黏附性的乳杆菌。黄燕华等[41]通过黏附抑制模型研究发现，在饲料中添加乳酸菌对奥尼罗非鱼的免疫和抗氧化能力具有提高作用。黏附抑制的检测方法简单易行，在实验研究中应用较广，但由于该实验方法灵敏度相对较低，工作量较大，实验结果只能部分反映菌株的黏附能力，所以并不是最理想的模型，不适用于大规模的检测。

1.5 体内黏附模型

随着实验技术和仪器设备的发展，应用高通量测序、荧光原位杂交(FISH)和脉冲场电泳(PFGE)等技术已经能够精确地检测到微生物在宿主肠道的定殖情况。张棋等[42]通过点种法和牛津杯法，从中华鳖肠道中筛选到 1 株对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌(Aeromonassobria)以及豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)等具有拮抗作用的菌株。Zhou 等[43]通过 rpo B-PCR 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术，研究了黏附在斑马鱼(Barchydanioreriovar)肠道中的乳酸杆菌的多样性，通过嗜水气单胞菌侵染实验验证了黏附菌株定殖力的强弱。体内黏附模型多数是通过饲养试验后，再采用高通量测序、荧光原位杂交和脉冲场电泳等技术检测益生菌在宿主肠道的黏附效果[44]。它是目前运用最普遍，也是最准确的一种黏附力评估模型。

随着分子生物学技术的发展，一些新的黏附模型也正在被逐步研究发掘。Schultz等[45]通过将携带改造过的GFP基因高拷贝数的质粒转入1株治疗溃疡性结肠炎的大肠埃希菌Nissle1917，建立了一种新型的转基因黏附模型，但由于GFP在体内的表达并不稳定，这一模型仍在研发阶段。Rodes等[46]采用细菌包覆的颗粒，模拟肠道内壁和其他特征建立了一种连续流式生物反应器，成为检测益生菌黏附力的新模型。由于该模型能够模拟宿主肠道环境，因此具有潜在的应用价值。

2 细菌黏附能力的检测方法

2.1 直接计数法

细菌黏附试验完成后，收集黏附在细胞上或黏液上的细菌，经梯度稀释后涂布平板培养并菌落计数，根据试验结果进行黏附效果的评价。这种方法操作比较简单，并且不需要特殊设备，在一般实验室就能进行操作，但是工作量非常大。

2.2 分光光度计法

分光光度法是通过使用染料对黏附在细胞上或黏液上的细菌进行染色，记录细菌黏附前后的吸光值变化，对黏附的细菌进行计数。这种方法操作简便，对试验设备要求较低，但要求待测的菌株黏附能力较强，且细菌的数量要足够多，否则可能达不到分光光度计的检测灵敏度要求。目前，研究者们经常应用分光光度法测定微生物黏着碳氢化合物法测定疏水性和细菌的自凝聚能力，对细菌黏附性进行预测和初步筛选[47]，作为菌株筛选非常有效的辅助手段。张明辉等[48]以HT-29 细胞为体外黏附筛选模型，采用分光光度计法分析了植物乳酸菌菌株黏附能力与表面疏水性、自聚共聚能力等表型特征的相关性，进而建立植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)黏附力与表面特征关系的模型，为筛选高黏附性植物乳酸菌提供了参考。

2.3 放射性同位素法

这种方法具有试验结果更为准确、检测灵敏度高及试验的重复性好等优点。目前常用的放射性同位素有H3、51Cr和I125，最常用的是H3标记的胸腺嘧啶核(TdR)。细菌对黏液蛋白的黏附率是通过测定用放射性物质标记的细菌在与固定化黏液蛋白黏附前后的放射量之比[49]，也有研究者使用细菌与固定化黏液蛋白黏附固定后的放射量，与该菌在牛血清白蛋白(BSA)模型黏附后放射量之比来表示[50]。放射性同位素标记法一般试验成本较高，同时也存在较大的安全隐患。

2.4 荧光标记法

荧光标记法类似于放射性同位素法。主要是将标志物与底物温育后冲洗，采用戊二醛固定处理，然后直接通过流式细胞仪或荧光显微镜观察底物黏附的细菌数目[51]。该方法常用异硫氰酸荧光素(FITC)作为标志物。根据一些细菌的特性，也可以选择其他荧光物质进行标记，有研究者用细胞增殖示踪荧光探针(CFDA-SE)标记细菌，通过测定细菌与细胞黏附前后荧光物质的发光强度，评价细菌对细胞的黏附能力[52]。也有研究者在荧光检测之前将包含编码荧光蛋白的基因质粒转入到乳酸菌内，以荧光强度评定细菌的黏附力[53]。荧光标记法操作复杂，对试验设备要求较高，并且随着时间的延长，荧光物质的荧光性会慢慢减弱，同时，荧光标记能够改变细菌的表面特性或影响细菌的存活能力，从而影响实验结果的可靠性，因此该方法在实际应用中较少。

2.5 细菌特异性抗体

应用此方法的前提是先制备细菌或表面物质的单克隆抗体，用该抗体与细胞做ELISA或蛋白印迹试验，获得目标黏附素。该方法能准确地寻找到菌株在宿主的黏附位点，有利于进一步深入挖掘菌株与宿主的黏附机制。但是在试验过程中极易出现交叉反应[54]，误导试验结果。当处理样品较少时，由于前期制备抗体的工作量较大，并不适合用此方法。但是如果有特异性好的抗体时，采用ELISA 法能更好地检测细菌的黏附性，该技术操作简便，可同时处理大量样本[55]。受抗体的影响，该方法的发展受到了极大地限制。

随着近几年基因组学和分子生物学的迅速发展，高通量测序、荧光原位杂交和脉冲场电泳等技术已经能够精确地检测到微生物在宿主肠道的定殖情况，极大地提高了检测益生菌在活体肠道内黏附能力的准确性。例如，前文提到的Schultz等文献采用转基因技术建立的新模型就能够简单准确地检测细菌的黏附状况。因此，随着生物技术的发展，细菌黏附性的检测技术会取得更大的进步，也会产生更多更高效的益生菌黏附模型。

3 展 望

在健康养殖的大背景下，养殖业对高黏附性益生菌的需求愈发强烈，因此建立一个合适的益生菌黏附力评估模型尤为重要。然而，从目前的研究手段来看，仅应用一种黏附模型来评估菌株的黏附力并不能真实反映菌株对宿主肠道的黏附效果。应该同时采用体内体外多种模型，结合现代分子生物学技术，综合分析菌株在多种模型中的黏附效果，才能相对准确地获得菌株在宿主肠道中的黏附特性。