林杆菌SK200a-9的重金属铊积累与钾离子的关系

刘姣姣， 刘菊梅， 张 笛， 木其尔， 袁 浩，赵 吉，2， 郭 永， 太田宽行， 包智华,2*

(1.内蒙古大学 生态与环境学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.内蒙古大学 内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室, 内蒙古 呼和浩特 010021；3.日本茨城大学 农学部，茨城县阿见町 300-0393)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 实验菌株Alsobactermetallidur-

ansSK200a-9和重金属污染沉积物分离菌株Bacillussp. HK1均由日本茨城大学太田宽行教授提供，-80 ℃冰箱保藏。

1.1.2 培养基及主要试剂 ①PY培养基(g/L)用于菌株复壮：酵母提取物2.0，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 1.0；②AA合成培养基[15](g/L)：Tris(50 mmol/L) 6.05，Na2SO40.5，KH2PO40.2，MgCl2·6H2O 0.4，NaCl 1.2，NH4Cl 0.3，KCl 0.3，CaCl20.11，酵母提取物 (Difco) 1，CH3COONa 20，微量元素溶液A 10 mL，微量元素溶液B 10 mL，刃天青溶液(0.1%) 10 mL，其中微量元素溶液A、微量元素溶液B及刃天青溶液(0.1%)需单独配制；③微量元素溶液A(g/L)：EDTA(2Na)·2H2O 1，FeSO4·7H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 0.2，H3BO30.05，CoCl2·6H2O 0.15，CuSO4·5H2O 0.15，NiCl2·6H2O 0.025，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1，Na2WO4·2H2O 0.05；④微量元素溶液B(g/L)：Na2SeO3·5H2O 0.05；⑤50 mmol/L的Tl储备液：准确称取2.60 g TlNO3，溶解于超纯水中，定容至200 mL；⑥ 256 mmol/L的KNO3储备液：准确称取5.18 g KNO3，溶解于超纯水中，定容至200 mL。

1.1.3 仪器与设备 高压灭菌锅(Auto clave-G136D，美国 ZEALWAY)，恒温振荡培养箱(HZQ-F160，中国 HDL APPARATUS)，高速冷冻离心机(ROTINA 380R，德国 Labsun)，超微量紫外分光光度计(Nano Photometer P-class P360，德国 IMPLEN)，原子吸收光谱仪(iCETM3300 AAS，美国 Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 菌株生长曲线的测定 用无菌移液器吸取250 μL制备好的细胞悬液于10 mL含1 mmol/L Tl+的PY液体培养基中，以未添加Tl+的液体培养基作为空白对照，每组实验2个平行样，所有样品置于试管中，恒温振荡培养箱中30 ℃、160 r/min培养。在不同时刻取样，用紫外分光光度计测定660 nm处的光密度，绘制菌株生长曲线。

1.2.2 菌株对重金属铊的吸附实验 吸取20 mL用AA培养基制备好的细胞悬液于500 mL含1 mmol/L Tl+的AA液体培养基中，将培养基转移至恒温振荡培养箱中30 ℃、160 r/min培养，以未接种的培养基作为空白对照，每组实验2个平行样。在对数生长期将培养液离心(4 000 r/min，15 min)，吸取5 mL上清液作为待测值，收集菌体。用5 mL 0.5 mmol/L EDTA洗脱菌体5次，每次洗脱之后4 000 r/min离心15 min，取上清液5 mL作为待测样品。将所有待测样品用0.22 μm滤膜过滤，原子吸收光谱仪测定样品中的Tl含量。

1.2.3 添加Tl对细胞内Tl+积累量的影响 在K+浓度为AA培养基中的原始浓度0.04 mmol/L的条件下，将菌株SK200a-9和HK1分别接种于装有500 mL AA培养基的锥形瓶中，设置Tl+最终浓度为0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L，选取未添加Tl+的培养液作为空白对照，每组实验2个平行样，30 ℃、160 r/min恒温培养。在对数生长期离心收集菌体，5 mL 0.5 mmol/L PIPES洗脱菌体5次后再次收集菌体。加入2 mL 60%浓硝酸，80 ℃消解3 h；冷却后加入500 μL H2O2，90 ℃水浴1 h；最后用1%浓硝酸补足至5 mL。0.22 μm的滤膜过滤，测定溶液中Tl+和K+的浓度。收集菌体80 ℃烘干8 h，用于细胞内离子浓度及生物量的计算。

1.2.4 添加K对细胞内Tl+积累量的影响 控制Tl+的浓度为1 mmol/L，调节K+的浓度为0、1、5、10 mmol/L，设置1组不加Tl+和K+的空白对照，每组实验2个平行样，30 ℃、160 r/min恒温培养。按照1.2.3方法考察添加K+对细胞内Tl+积累量的影响。

1.2.5 静止细胞实验 为测定细胞内积累的Tl+能否被K+逐出细胞外，在含有1 mmol/L Tl+培养基中培养菌株，在静止生长期取菌液5 mL作为待测样品(0时刻)，向培养液中添加最终浓度为1 mmol/L的K+，待培养液静置5、10、30 min时分别取5 mL菌液作为待测样品。将所有待测样品按照1.2.2方法洗脱细胞外吸附的铊，测定细胞中的Tl+和K+浓度。

1.2.6 样品中元素的测定 使用原子吸收光谱仪测定溶液中Tl+和K+的浓度。0.22 μm 滤膜过滤所有待测样品，采用火焰原子吸收光谱法测定细胞中Tl+和K+的浓度。

1.2.7 细胞中离子浓度的计算公式c=ε×5÷η

式中：c为细胞中的离子浓度，ng/mg DW(DW指干重)；ε为待测样品中的离子浓度，ng/mL；η为菌体干燥重量，mg。

2 结果与分析

2.1 菌株在不同培养条件的生长曲线

从图1可以看出菌株SK200a-9生长比较缓慢，在培养1 d后进入对数生长期，72 h的菌体光密度已接近峰值，OD660为0.97，进入稳定期；与空白对照相比，菌株SK200a-9在1 mmol/L Tl+胁迫下的生长基本不受抑制，说明该菌株对Tl具有较强的耐性。而对照菌株HK1生长较快，在培养12 h后进入对数生长期，培养24 h后进入稳定期；在1 mmol/L Tl+胁迫下的生长也基本不受抑制，说明该菌株对Tl也具有较强的耐性。

图1 菌株的生长曲线Fig.1 Growth curve of strains

2.2 菌株对Tl+的体外吸附

为了准确测定细胞内Tl+的积累量，进行了完全去除菌株SK200a-9和HK1细胞外吸附的Tl+的预实验。添加Tl+浓度为1 mmol/L，用0.5 mmol/L EDTA对细胞外吸附的Tl+进行洗脱。根据表1可知，洗脱4次才能将细胞外吸附的Tl+全部去除。所以在后续的细胞内Tl+的积累实验中，选择洗脱次数为5次，以保证实验结果的准确性。

表1 洗脱次数与上清液中Tl+的质量浓度

2.3 不同浓度Tl+对细胞内Tl+积累量的影响

由图2可知，K+浓度为培养基内的原始浓度时(0.04 mmol/L)，当Tl+浓度<1 mmol/L时，与空白对照组相比，随着培养基内Tl+浓度的增加，SK200a-9细胞内Tl+浓度增加的同时细胞内K+浓度减少，这可能是由于Tl的离子半径和K的离子半径相似，从而使Tl+通过K+运输系统代替K+进入细胞内。当Tl+浓度为1 mmol/L时，细胞内Tl+浓度达到最大量255.5 ng/mg DW，细胞内K+的浓度降到最低，为50.71%。而Tl+在对照菌株HK1细胞内最大积累量仅为41 ng/mg DW。此结果表明SK200a-9细胞内积累的Tl+远高于HK1，且细胞内的K+可能被Tl+代替。

2.4 K+添加对细胞内Tl+积累量的影响

由图3可知，当培养基内的Tl+浓度为1 mmol/L时，随着K+浓度的增加SK200a-9细胞内Tl+浓度增加(图3A)。当K+浓度为5 mmol/L时，细胞内Tl+的积累量达到最大值419.0 ng/mg DW，说明K+促进了Tl+在细胞内积累，可能是K+进入细胞时Tl+也随之进入，这些结果暗示了Tl+使用K+转运系统进入细胞内的可能性；当K+浓度>5 mmol/L时，随着K+浓度的增加细胞内Tl+的浓度开始降低，这可能是K+对Tl+在细胞内的积累产生了竞争。而菌株HK1在添加K+浓度为1 mmol/L时，细胞内Tl+的积累量达到最大值48 ng/mg DW，远低于SK200a-9细胞内的积累量。同时，在只添加Tl+或同时添加Tl+和K+的培养基内，菌株SK200a-9的最大生长量相对值基本没有变化(图3A)，这说明1 mmol/L Tl+并不会对菌株SK200a-9的生长产生抑制作用，菌株SK200a-9对重金属铊具有较强的耐性；菌株HK1的最大生长量稍有降低(图3B)，说明其对铊也具有较强的耐性。

2.5 静止细胞实验

由图4可知，在添加K+之前向培养基中添加1 mmol/L Tl+，30 ℃、160 r/min振荡培养，在对数生长期时菌体细胞内Tl+的积累量为100%，随后向培养基中加入终浓度为1 mmol/L的K+，在细胞的静置时间为5～30 min内，与对照菌株HK1相比(图4B)，SK200a-9细胞内的Tl+浓度由于K+的添加而随时间明显降低，细胞内K+浓度由于K+的添加而明显升高(图4A)。结果表明由于K+的加入，SK200a-9细胞内积累的Tl+向外排出，同时细胞外的K+进入细胞内。

图2 Tl+的添加对菌株细胞内Tl+积累量及K+相对浓度的影响Fig.2 Effect of Tl+ addition on Tl+ accumulation and relative abundance of K+ in cells of strains

图3 K+添加对菌株细胞内Tl+积累量及生长量的影响Fig.3 Effect of K+ addition on Tl+ accumulation in cells and relative biomass of strains

图4 菌株静止细胞在不同时刻细胞内Tl+的积累量Fig.4 The accumulation of Tl+ in static cells of strains at different time

3 讨 论

不同的微生物对铊的敏感程度、耐性机制有所差异。Norris等[19]进行了铊对微生物毒性的研究，耐性较低的巨大芽胞杆菌KM(MIC，0.015 mmol/L)、大肠埃希菌 (0.9 mmol/L) 和酿酒酵母 (0.75 mmol/L) 的铊毒性研究显示，巨大芽胞杆菌KM比酿酒酵母和大肠埃希菌对重金属Tl更敏感。本研究中使用的供试菌株SK200a-9(MIC，4.4 mmol/L)和HK1(MIC，3.9 mmol/L)铊耐性较强(Bao et al.，2006)，在1 mmol/L Tl+胁迫条件下生长不受抑制。但是SK200a-9细胞内Tl+的最大积累量(255.5 ng/mg DW)远大于对照菌株HK1的积累量(41 ng/mg DW)，说明SK200a-9菌体内的Tl+容许度大于HK1。这种差异可能是由于两株菌对Tl+的耐性机理不同造成的。培养基中1 mmol/L Tl+存在时SK200a-9细胞内Tl+基本达到饱和，但并没有产生毒性，原因可能有以下几个方面：①通过细胞表面吸附抑制其进入细胞内；②进入细胞后又排到细胞外降低对细胞的毒害作用；③进入细胞后与某些蛋白质结合失去其毒性；④转换成毒性较低的价态降低对细胞的毒害。

本研究中，培养基中K+和Tl+的浓度对菌株SK200a-9细胞内Tl+的积累量有很大影响，但对HK1基本没有影响。这与静止细胞实验结果比较类似：SK200a-9细胞内积累的Tl+被K+置换比较明显，而HK1不明显。添加K+明显促进了SK200a-9细胞内Tl+的积累，但对HK1的促进作用要小得多。这可能是由于两种生物体对K+和Tl+摄取的相对亲和力不同，Tl+作用的位点不同。Tl+和K+的比值增加到1∶5时细胞内Tl+浓度也最高(419 ng/mg DW)，但对相对生物量几乎没有影响，说明K+的添加促进了细胞内Tl+的积累，而且Tl+优于K+保留在细胞中。已知研究表明Tl+在细胞内的积累与K+的运输系统有关[19]，随培养基中Tl+浓度增加，其在细胞内积累量增加，K+浓度减少，这与本研究结果一致。而 Damper等[20]的研究表明大肠埃希菌对Tl+的积累主要通过Kdp(一种K+转运系统)或者Trk进行，而且细胞内积累的Tl+也被K+置换出细胞外。K+添加的SK200a-9静止细胞实验结果也暗示了Tl+在SK200a-9细胞内的积累是通过K+运输系统的可能性。

综上所述，铊耐性菌株SK200a-9细胞内Tl+积累量远大于菌株HK1。K+浓度为培养基中的原始浓度(0.04 mmol/L)时，由于Tl+的添加SK200a-9细胞内Tl+浓度增加，K+的浓度下降，表明SK200a-9细胞内的K+可能被Tl+代替，但无毒害作用；Tl+浓度为1 mmol/L时SK200a-9细胞内积累量达到255.5 ng/mg DW。K+的添加促进SK200a-9细胞内Tl+的积累。SK200a-9细胞内积累的Tl+，由于K+的加入而降低。根据以上结果初步判断，SK200a-9的铊耐性机理可能是Tl+代替K+进入细胞内积累，而K+也能使其排到细胞外。本研究中Tl+在细胞内积累过程中膜蛋白的变化等有待进一步研究。