不同浓度Fe2+和Cu2+胁迫对灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达水平的影响

胡楚霄， 唐恬恬， 师 展， 罗霆宇， 向泉桔

(四川农业大学 资源学院微生物系，四川 成都 611130)

我国是世界食用菌生产第一大国，食用菌产量达到世界工厂化总产量的43%[1]。随着工业的快速发展、“三废”的大量排放以及不合理的施肥和农药的使用，土壤和栽培基质(木屑、秸秆等)的重金属污染对食药用菌人工栽培的影响越来越大[2-3]。目前在食用菌中常见被检出的超标重金属有铜、锌、镍、镉等[4]。因此，开展相关研究对于评价其环境污染风险、保护人体健康、保障食品安全具有重要意义。 食用菌富集与转运重金属的机制主要包括产生抗氧化酶、离子交换、与大分子结合形成沉淀、肽转运等[5]。肽转运是生物中普遍存在的一种现象，其中寡肽转运蛋白(Oligopeptide transporter，OPT)是肽转运的通道之一，能转运4～8个氨基酸的短肽。寡肽转运蛋白的功能多样，可以协助胞外物质向胞内转运，参与营养的分配及金属耐受性和解毒等，其转录表达受培养条件、生长阶段等外界因素的影响[6]。寡肽转运蛋白基因的表达量的大小与菌丝体富集的重金属量密切相关。OPT蛋白最先在致病白色念球菌中发现[7]，随后相继在拟南芥、水稻、黄孢原毛平革菌等物种中发现[8]，目前研究最多的是拟南芥OPT基因家族。Pu等[9]研究表明，在长期的进化过程中，金属离子对于OPT基因家族的多样性起到了很重要的作用，例如BrrOPT8.1和BrrYSL7分别对铁和钙离子有特化响应，表明不同的OPT基因对于金属离子的响应存在差异。 灵芝是一种名贵的药食两用真菌，富含丰富的甾醇、萜类等生物活性物质，现已实现大规模人工栽培[10]。栽培基质和土壤中的金属可能会影响灵芝的生长发育。本课题组前期研究结果显示[11-12]，灵芝的生长发育、多糖含量及OPT基因的转录表达水平受到多种金属离子的影响，其中Cu2+和Fe2+的胁迫下，OPTs基因在不同发育阶段 (15 d和30 d)的转录表达水平发生较大的变化，显示出这两种金属离子对于OPTs基因具有较大的影响。为进一步分析Cu2+和Fe2+处理对OPTs基因的影响，本研究设置了不同浓度梯度的Cu2+和Fe2+，分析其对灵芝生物量、多糖含量以及OPT基因转录表达水平的变化，为进一步阐明这两种金属离子对于灵芝生长发育的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 灵芝菌种荣保1号，由四川农业大学微生物系提供。

1.1.2 培养基 PDA固体培养基；PDB液体培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，pH自然，定容至1 000 mL。

1.1.3 主要试剂与仪器 CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、琼脂粉、无水葡萄糖、98%硫酸(分析纯，四川西陇科学化工有限公司)；无水乙醇(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)；Trizol Reagent(上海生工生物试剂有限公司)；FastQuant cDNA合成试剂盒(天根生化科技有限公司)；SYBR Green Master Mix(唯诺赞生物科技有限公司)。荧光定量PCR仪(iQ5型，美国Bio-rad公司)；分光光度计(V-1100D型，美谱达)。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与培养 将CuSO4·5H2O和FeSO4·7H2O配置成50 mg/L的母液，其中CuSO4·5H2O 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，FeSO4·7H2O使用0.22 μm滤膜过滤除菌。菌种保藏与活化使用PDA固体培养基，菌种的培养使用PDB液体培养基。每个250 mL锥形瓶中加入50 mL PDB培养基，115 ℃灭菌 20 min。灭菌后添加一定量的金属离子母液，至预设浓度(0、50、100、200、400 mg/L)。每个三角瓶接种3块活化的菌丝体(直径1 cm)，30 ℃避光恒温静置培养。每个处理设置3个重复。

1.2.2 生物量测定 取完整的菌丝体，60 ℃烘至恒重，于分析天平上称取重量，数值记为生物量测定值。

1.2.3 多糖含量测定 利用苯酚-硫酸比色法测定灵芝粗多糖含量[13]，具体步骤如下：准确称取烘干后的菌丝体0.5 g，加入50 mL超纯水与1 mL 1%的纤维素酶，静置30 min，然后沸水回流提取2 h。将液体转入离心管中，低速(6 000 r/min)离心5 min，取500 μL上清，加入3倍体积无水乙醇至终浓度75%，4 ℃醇沉过夜。室温高速(12 000 r/min)离心5 min，去上清，烘干沉淀。加入1 mL超纯水溶解沉淀，再加入1 mL sevage(氯仿∶正丁醇=5∶1)试剂反应30 min去除蛋白质。吸取400 μL上清液加入1 mL 5%苯酚溶液与5 mL 98%浓硫酸，室温反应30 min，490 nm波长处测定吸光度值。

1.2.4 总RNA提取 取少量液氮保存的菌丝体，研磨成粉末状，利用Trizol法提取总RNA[14]，具体步骤如下：将样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中研磨成粉末状，装入预冷的1.5 mL离心管中；向样品离心管中加入1 mL Trizol试剂，迅速震荡摇匀，室温静置5 min；向匀浆裂解液中按每1 mL裂解液试剂加入200 μL的比例加入氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min；12 000 g、4 ℃离心5 min；吸取上清液转移至另一离心管中，向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒至充分混匀，室温静置10 min；12 000 g、4 ℃ 离心10 min；弃上清，向离心管中加入l mL 75%乙醇，洗涤离心管管壁，12 000 g、4 ℃离心5 min；弃去乙醇；室温干燥沉淀至乙醇完全挥发，加入50 μL RNase-free水溶解沉淀。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.5 cDNA合成 检测合格的RNA使用FastQuant cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA。具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 qRT-PCR分析 以合成的cDNA为模板，对相关OPT基因进行qRT-PCR分析，以未加金属离子的CK为对照，计算OPT基因在特定环境下转录表达情况。qRT-PCR在iQ5荧光定量PCR仪上进行。荧光定量PCR反应体系共计10 μL，具体如下：Green Master Mix 5μL，Rox Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，引物0.4 μL，加入ddH2O补足至10 μL。qRT-PCR分析具体程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重复40个循环，60 ℃退火。以灵芝RPL4基因为内参基因[15]，所用引物序列参照文献[16]，通过熔解曲线判定引物的特异性，利用双δ法计算基因的相对表达量。

1.2.7 数据分析处理 实验数据利用Excel进行数据整理计算制表，利用Spss Statistics17.0进行显著性分析，利用Origin进行作图。

2 结果与分析

2.1 Fe2+和Cu2+对灵芝生物量的影响

不同浓度Fe2+和Cu2+作用下，灵芝的生物量如表1所示。结果显示，培养前期(15 d)，不同浓度Fe2+对灵芝的生长具有一定的促进作用，随着Fe2+浓度的增加，生物量也有一定程度的增加，不同浓度的Cu2+对灵芝生长则存在一定的抑制作用，随着浓度的增加，生物量不断降低。与培养前期变化趋势一致，培养后期(30 d)不同浓度Fe2+表现出促进作用，但不同浓度Cu2+则表现出抑制作用。在所有的培养条件下，培养后期的生物量均低于培养前期，这可能是由于培养后期，随着营养物质快速消耗，导致菌丝生长进入了稳定期甚至衰亡期。

2.2 Fe2+、Cu2+对灵芝多糖含量的影响

培养前期(15 d)，两种金属离子均抑制灵芝多糖的生物合成，不同浓度处理下多糖的含量均低于对照组；培养后期(30 d)，两种金属离子对灵芝多糖的生物合成具有一定的促进作用，Fe2+和Cu2+分别在200 mg/L和400 mg/L的促进作用最明显，其多糖含量分别达到1.39%和1.30%(表2)。

表1 不同浓度Fe2+和Cu2+对灵芝生物量影响(g)

注：表中小写字母表示在α=0.05条件下的显著性检验结果，下表同

表2 不同Fe2+和Cu2+对灵芝胞内多糖含量影响(%)

2.3 Cu2+和Fe2+胁迫下灵芝OPTs基因的转录表达情况

利用qRT-PCR分析不同Cu2+和Fe2+浓度胁迫下灵芝寡肽转运蛋白家族的响应特征。与已有研究结果类似[14]，本研究仍未检测到OPT7、OPT8和OPT9的转录本，其余10个基因均出现了差异性和特异性表达。

不同浓度Cu2+胁迫下，在培养15 d的样品中，OPTs基因表达水平较低，且大多数基因表达水平差异不大；而在30 d的样品中，表达水平较15 d的样品明显增加，且所有的基因表达水平均存在差异。15 d样品中，在不同Cu2+浓度下5个基因(OPT1、OPT2、OPT3、OPT4和OPT11)的转录表达水平较小，差异无统计学意义；OPT5、OPT6和OPT13分别在Cu2+质量浓度为200 mg/L、400 mg/L和50 mg/L时转录表达水平最高，其中OPT6在浓度为400 mg/L时的转录表达水平是CK的33.59倍；OPT10和OPT12的转录表达存在一定的波动性，但这两个基因均在Cu2+浓度为50 mg/L和200 mg/L的样品中转录表达水平相对较高。30 d样品中，Cu2+胁迫下所有基因的转录表达水平均不同程度提高，其中4个OPT基因(OPT1、OPT2、OPT12和OPT13)均在Cu2+质量浓度为100 mg/L时转录表达水平最高，分别为CK的47.27、118.01、6.10和41.95倍，另外5个OPT基因(OPT3、OPT5、OPT6、OPT10和OPT11)在Cu2+质量浓度为400 mg/L时的转录水平最高，分别为CK的5.37、4.84、36.73、17.87和6.04倍(图1)。

不同浓度Fe2+胁迫下，各基因表达差异水平均较大。在培养15 d的样品中，OPTs基因表达水平较Cu2+高。而30 d培养的样品中，2个OPTs基因(OPT3和OPT11)表达水平不及15 d，另有2个OPTs基因(OPT1和OPT4)明显高于15 d。15 d样品中，除OPT4基因外，各基因在Fe2+质量浓度为50 mg/L与400 mg/L时表达量较高。OPT5、OPT6和OPT10为表达量最大的基因：在质量浓度为50 mg/L时分别为CK的35.61、207.48和102.39倍；在质量浓度为400 mg/L时分别为CK的33.61、164.31和139.27倍。其余浓度条件下，各基因表达量与差异性均较小，大部分较CK下调。30 d样品中，6个OPT基因(OPT1、OPT2、OPT3、OPT5、OPT12和OPT13)在Fe2+质量浓度为200 mg/L时表达量最大，分别为CK的32.63、9.67、6.87、14.67、12.69和7.89倍，另外3个OPT基因(OPT6、OPT10和OPT11)在Fe2+质量浓度为400 mg/L时表达量最大，分别为CK的132.62、32.06和19.70倍(图2)。

图1 OPTs在不同Cu2+浓度胁迫下不同培养阶段的相对表达量Fig.1 Relative expression levels of OPTs under different concentrations of Cu2+ treatments and culture stages

图2 OPTs在不同Fe2+浓度胁迫下不同培养阶段的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of OPTs under different concentrations of Fe2+ treatments and culture stages

3 讨 论

在食用菌培养过程中，添加适量的金属离子可以促进其生长发育[17]，但是关于诱导机制的研究报道相对较少[18-19]。蔡爱群等[20-21]研究发现，当Fe2+质量浓度低于800 mg/L、Cu2+质量浓度低于100 mg/L，均可以明显促进灵芝的生长。本研究中，不同浓度Cu2+抑制菌丝的生长，生物量降低，这可能是由于不同灵芝菌株对金属浓度敏感性存在差异。 王新民等[22-23]的研究结果显示当Fe2+含量为0.2%时，多糖产量最高。与此结果相似，本研究中Fe2+质量浓度为200 mg/L时，灵芝胞内多糖含量最高。 寡肽转运蛋白的功能多样，可以协助胞外物质向胞内转运，参与营养的分配及金属耐受性和解毒等，其转录表达受培养条件、生长阶段等外界因素的影响[7]。通过酵母异源表达研究证实拟南芥AtOPT3可以转运Cu2+、Mn2+和Fe2+三种金属离子[24]。Hu等[25]研究发现，缺Fe2+环境下高富集植物天蓝遏蓝菜OPT3(TcOPT3)在茎和叶中的转录表达水平比对照显著增高，且均随着培养时间的延长，转录表达水平有下降的趋势。突变酵母菌验证实验证实TcOPT3不仅可以转运Fe2+，还可转运Zn2+、Cd2+和Cu2+，说明TcOPT3是一个新的转运Fe/Zn/Cd/Cu的蛋白。本研究结果表明不同Cu2+和Fe2+浓度处理下，灵芝OPT基因在不同发酵阶段(15 d和30 d)具有差异性表达特征，这些结果表明OPT基因在多种生物金属离子的转运和耐受过程中起着重要的作用。

不同浓度Fe2+和Cu2+对灵芝不同发酵阶段的生物量、多糖含量以及OPTs基因的转录表达有不同程度的影响。Fe2+处理促进灵芝生长，生物量增加；相反Cu2+抑制灵芝生长；两种金属离子在培养前期(15 d)对多糖合成有一定的抑制作用，而在后期(30 d)则表现为促进；OPTs基因在转录水平上对不同浓度Fe2+和Cu2+的响应特征差异较大，其中不同浓度Cu2+处理下，培养前期OPTs基因表达水平较低，且差异不大，而培养后期表达水平较15 d的样品明显增加，且均存在差异；相反Fe2+质量浓度为50 mg/L和400 mg/L，绝大多数OPTs基因在培养前期的转录表达水平显著提高。