马铃薯SERKs家族基因的分离及其在植物免疫信号中的功能

张金龙，吴玉俊，肖成斌，方显明，王桠楠，成宏斌，郑晟，杨宁，杜捷，高坤，武国凡，吴旺泽

(1.西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070；2.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州 730030)

植物在应对各种生物及非生物胁迫时，植物类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases,RLKs)能通过胞外结构域结合或识别各种生物、非生物胁迫信号分子，并与之形成二聚体将胞外刺激信号传递到细胞内，从而将外界各种生物、非生物胁迫信号级联放大传递至下游，调控下游基因的表达来应对各种胁迫刺激[1].亮氨酸富集型受体激酶(leucine rich repeat receptor-like kinase,LRR-RLK)第二家族的体细胞胚胎发生受体激酶(somatic embryogenesis receptor-Like kinases,SERKs)亚家族是目前为止研究的较为深入的一类LRR-RLKs.SERKs家族明显的特征就是在胞外区具有5个串联重复的LRR，并且胞外具有丝氨酸-脯氨酸富集的结构域(serine-proline proline,SPP).SERKs广泛分布于双子叶和单子叶植物中，甚至在低等植物地钱属和绿藻类中也有分布[2].

SERKs家族基因在不同的物种间、甚至同一物种间都存在生物学功能遗传多样性.而且其生物学功能在各个物种之间并不完全功能冗余，特别是对病害侵染的先天性免疫方面的功能更为复杂和多样[3].拟南芥中的5个SERKs家族基因，不仅参与油菜素内酯(brassionsteroid,BR)介导的生长发育，还参与了雄性小孢子、气孔、根及花器官的发育等各个方面[4-10].更为重要的是SERKs家族基因还广泛参与植物免疫应答，特别是SERK3/BAK1不仅参与了真菌性病害的免疫应答，还参与了RNA病毒的抗性调节[11-13].前期的研究结果显示，FLS2的配体flg22可以诱导BAK1与FLS2形成异源二聚体介导FLS2调节的免疫信号.SERKs家族其它成员也能够和FLS2产生相互作用.BAK1还能和EFR以配体依赖性的方式相互作用介导免疫信号.AvrPto和AvrPtoB也可与BAK1互作从而干扰FLS2和BAK1的偶联进而削弱PAMP信号通路调节免疫信号[14-15].除了在拟南芥中，在烟草、水稻、番茄、棉花等农作物中鉴定到了大量的SERKs，它们不仅参与生长发育还参与了大量未知的免疫调节机制[16-21].

马铃薯是易感病害的农作物，各种病害严重制约了马铃薯产业的发展.到目前为止，对马铃薯免疫抗病机理还知之甚少[22-25].拟南芥SERKs家族、尤其是BAK1作为诸多免疫信号受体的共受体，通过和受体以配体依赖性的方式相互作用介导免疫信号，调节植物的病害抗性.这方面的研究为探索马铃薯免疫抗病研究提供了启示.但目前，对马铃薯SERKs家族基因参与的生长发育、尤其是先天性免疫病害抗性方面的分子机理鲜有报道[26-27].本研究克隆了3个马铃薯SERKs家族基因，利用实验室成熟的拟南芥免疫应答系统，初步研究马铃薯SERKs家族基因参与先天性免疫应答的分子机理，对马铃薯先天性免疫抗病机制的理解、也为创建马铃薯抗病种植种资源提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 马铃薯SERKs家族基因Blast比对及进化树分析

在PLAZA(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)数据库中用拟南芥SERKs家族基因氨基酸序列同源比对马铃薯蛋白质数据库，比对近似的马铃薯SERKs家族基因利用DANMAN，CluterX进行序列比对，利用在线SMART和PFAM分析LRR、SPP和蛋白激酶结构域，用MEGA6.0软件做进化树分析.

1.3 马铃薯SERKs家族基因克隆和拟南芥转化

比对正确的马铃薯SERKs基因CDS序列及启动子序列，用Primer Premier 5软件设计基于Gateway技术的接头引物.提取马铃薯RNA反转录后用PCR技术克隆马铃薯SERKs家族基因的CDS序列和启动子序列，BP反应后测序鉴定，测序正确后，进行LR反应将其连入表达载体pBIB-BASTA-35S-GWR-YFP和pBIB-BASTA-GWR-GUS，然后转入农杆菌GV3101中.用浸花法将马铃薯SERKs家族基因转入拟南芥相应背景材料，在土壤中用0.1%的basta筛选T1代种子.引物序列如表1所示.

表1 PCR引物序列

1.4 转基因植株鉴定及基因表达分析

Basta筛选阳性的T1lines，利用PCR和Western blot方法鉴定转基因的真实性，经basta、PCR和Western blot三重鉴定阳性的T1代植株单株收获.提取T2代28 d幼苗RNA进行半定量RT-PCR验证转基因植株中马铃薯SERKs家族基因的相对表达量，RT-PCR反应体系及程序如表2和表3所示.为了从分子水平证实是否马铃薯SERKs家族基因参与免疫反应，提取了土壤中生长12 d幼苗RNA，qRT-PCR分析水杨酸响应基因PR1和细胞死亡的标记基因FMO1，以及水杨酸合成标记基因SID2和EDS1的表达(表4～5).半定量qRT-PCR以ACTIN2作为内参基因，试验重复3次.

表2 PCR扩增程序

表3 半定量RT-PCR体系

表4 实时定量RT-PCR反应体系

表5 qRT-PCR反应程序

1.5 台盼蓝染色和二氨基联苯胺(DAB)染色

取生长11 d的幼苗子叶，通过台盼蓝和DAB染色，检测幼苗子叶细胞死亡程度和活性氧的积累[28].

1.6 蛋白提取和Western blot分析

1.7 GUS染色

选取马铃薯SERKs家族基因CDS上游800～1 500 bp序列设计启动子引物，通过Gateway构建自身启动子驱动的Promoter:GUS的转基因植株，T1代植株经basta和PCR鉴定后单株收获.通过GUS染色来检测马铃薯SERKs家族基因在植物组织中的表达模式[29].

2 结果与分析

2.1 马铃薯StSERKs基因的克隆及序列分析

在PLAZA数据库中利用拟南芥SERKs家族基因氨基酸序列在马铃薯基因组数据库中共搜寻到12个候选基因.将12个候选基因的氨基酸序列和拟南芥中的5个SERKs基因氨基酸序列用MEGA6.0软件做进化树分析(图1-A)，结果表明，马铃薯中的ST04G027320和拟南芥的SERK1和SERK2在同一分枝，ST10G013940和ST01G0-40020与拟南芥的BAK1在同一分枝.所以初步确定这3个基因可能为马铃薯中的SERKs家族基因.然后将这3个基因在NCBI中进行BLAST分析，结果显示，ST04G027320、ST10G013940和ST01G040020分别对应NCBI中马铃薯的SERK1、SERK3A和SERK3B，其在NCBI中的登录号分别为EF175215.1、KC914391.1和KC 914392.1.

SERKs家族基因，区别于其他RLKs最明显的特征是在胞外具有5个LRR，含有丝氨酸和脯氨酸富集的SPP区域.虽然序列比对到的3个马铃薯SERKs家族基因和拟南芥SERKs基因高度同源，最终确定它们是否是SERKs家族基因还需确定它们是否拥有5个串联重复的LRR，SPP及保守的激酶区.利用SMART和PFAM在线软件分析马铃薯3个SERKs基因特征结构域.结果表明，马铃薯3个SERKs基因具有SERKs家族的信号肽结构域、SPP结构域、胞内激酶结构域，胞外有5个串联重复的LRR结构域，而且他们都具有“RD” motif结构域，因此它们也是3个“RD” RLK(图2).至此可以确定ST04G027320、ST10G013940和ST01G0-40020是马铃薯SERKs家族基因.提取马铃薯RNA反转录为cDNA，利用Gateway技术从马铃薯中克隆这3个马铃薯SERKs家族基因.测序结果显示ST04G027320、ST10G013940和ST01G040020开放阅读框分别为1 890、1 848、1 848 bp;分别编码628、615、615 aa.依据序列比对和进化树分析结果，我们命名ST04G027320、ST10G013940和ST01G040020为StSERK1、StSERK3A和StSERK3B(图2).

SERKs基因是1类非常保守的家族基因，在植物界广泛分布.为了分析马铃薯与其他农作物中SERKs基因的亲缘关系，本研究选取单子叶植物水稻、玉米，以及双子叶植物拟南芥、烟草、番茄与马铃薯SERKs基因的氨基酸序列做进化树分析，各基因的名称、基因序列登录号和蛋白序列号见表6.结果表明，马铃薯SERK1、SERK3A和SERK3B与同科番茄中的SlSERK1、SlSERK3A和SlSERK3B亲缘关系较近(图1B)，这些结果也证实我们鉴定的StSERK1、StSERK3A和StSERK-3B是马铃薯SERKs家族成员.

A：拟南芥SERKs与马铃薯SERKs进化树；B：不同物种SERKs家族基因进化树.A：Phylogenetic tree of SERKs from Arabidopsis and Solanum tuberosum；B：Phylogenetic tree of SERKs from different species.图1 SERKs基因进化树Figure 1 Phylogenetic tree of SERKs

2.2 马铃薯StSERKs基因表达模式分析

为研究马铃薯StSERKs基因的组织表达模式，3个StSERKs基因起始密码子上游约1 500 bp处启动子序列被克隆，通过Gateway技术克隆进pBIB-BASTA-GWR-GUS启动子分析表达载体，利用浸花法转入Col-0，进行组织表达分析(图3).每个StSERKs基因选择2个不同的株系进行分析.选取14 d的真叶和地上部分莲坐叶、35 d的果夹和花絮进行GUS染色活性分析.结果表明，StSERK1在真叶、果夹顶端和基部、花絮中都有微弱的表达；但StSERK3A在真叶、果夹和花絮中都有很强的表达；然而StSERK3B在真叶、果夹和花絮中的表达都比StSERK3A要弱，而在花絮中其表达又比StSERK1的强.有意思的是，14 d的幼苗除了StSERK3A，StSERK1和StSERK3B在子叶中都没有观察到GUS信号(图3).

表6 7种植物的SERKs基因信息统计

“*”表示克隆序列的突变位点；“”表示RD motif.“*” indicates the mutant site of the cloned sequence；“”indicates the RD motif.图2 马铃薯StSERKs家族氨基酸序列和拟南芥SERKs氨基酸序列比对及结构域分析Figure 2 Amino acid sequence alignment and domain analysis of potato StSERKs and Arabidopsis SERKs

A、B：14 d真叶、莲座叶(比例尺=1 mm)；C、D：35 d果夹、花絮(比例尺=5 mm).A,B：14 days of true leaves，lotus leaf (scale bar=1 mm)；C、D：35 days of fruit clips，tidbits (scale bar=5 mm).图3 马铃薯StSERKs的表达模式Figure 3 The expression pattern of StSERKs

2.3 超表达StSERKs对bak1-3 bkk1-1地上部分表型的影响

通过浸花法将35S启动子驱动的3个马铃薯StSERKs基因在拟南芥免疫激活型突变体bak1-3bkk1-1中超表达，验证3个马铃薯StSERKs基因是否参与免疫应答信号.经basta抗性筛选得到7个稳定遗传的转基因株系.利用RT-PCR和Western blot鉴定转基因的真实性，结果表明3个马铃薯StSERKs基因在bak1-3bkk1-1中均能正常表达(图4-B～C).并且bak1-3bkk1-1在22 ℃生长时地上部分植株弱小、叶片卷曲、叶柄缩短的地上部分表型被几乎完全抑制(图4-A).

2.4 超表达StSERKs对bak1-3 bkk1-1免疫活性的激活

前期的研究发现，拟南芥bak1-3bkk1-1双突表现出光诱导水杨酸积累的细胞死亡表型，同时bak1-3bkk1-1的第2层ETI免疫系统被激活，而这种可见的细胞死亡和ETI免疫反应相偶联.所以bak1-3，bkk1-1单突对Pst DC3000表现出易感病的表型，而bak1-3bkk1-1双突却产生对PstDC3000高抗的表型[30].遗传证据初步证明超表达马铃薯StSERKs能够抑制bak1-3bkk1-1地上部分表型，与bak1-3bkk1-1双突比较，StSERKs的转基因植株并没有可见的免疫激活的子叶死亡表型(图4-A)，是否超表达StSERKs真实的抑制了bak1-3bkk1-1免疫激活的子叶死亡表型，试验利用细胞死亡台盼蓝染色和DAB染色技术，间接来验证超表达马铃薯StSERKs是否真实的抑制了bak1-3bkk1-1双突免疫激活的细胞死亡表型(图4-A).取土壤中22 ℃培养11 d的Col-0,bak1-3bkk1-1和StSERKs超表达的2个株系幼苗子叶进行台盼蓝和DAB染色，结果显示除bak1-3bkk1-1有明显的细胞死亡和活性氧积累，其体内ETI途径被高效激活，而Col-0和StSERKs的转基因植株均没有观察到明显免疫系统被激活的细胞死亡和活性氧的积累，说明StSERKs的超表达确实能够抑制bak1-3bkk1-1免疫激活的表型(图5-A～B).

3 讨论

研究表明，在单子叶，双子叶甚至非微管束植物中发现了SERKs家族基因.经典的进化学说认为，基因的复制要么在进化中持续分离，要么丢失[31-32].虽然SERKs亚家族成员氨基酸序列高度保守，部分功能冗余，但彼此又有多样性的生物学功能.即使在拟南芥中，5个SERKs家族成员表现出了功能的多样性，SERK2在BR调节的信号中功能没有BAK1强大，但它的胞外结构域是拟南芥雄性孢子发生所必须的.SERK5，在拟南芥Col-0生态型中是一个“no-RD” LRR-RLKs，并且丧失了在BR信号和细胞死亡中的功能，而在Ler生态型中SERK5却是一个“RD” LRR-RLKs，并且能参与BR信号和细胞死亡的调控[33].这种SERKs家族基因功能的多样性可能来自于不同物种面对不同生态环境的选择所致，因此在不同植物物种产生了不同数量和不同功能的SERKs家族成员.在拟南芥中发现了5个SERKs家族基因成员，但在水稻中仅发现3个(OsSERK1,OsSERK2和OsSERK3)[16-17]，在棉花中发现了2个(GhSERK1和GhSERK3)[18]，而在玫瑰中却发现了4个(RhSERK1-RhSERK4)[19].本研究发现，在马铃薯中有3个SERKs家族基因(图1A)，它们具有SERKs家族基因典型的SPP结构域、LRR结构域、跨膜结构域和胞内激酶结构域，并且都具有“RD” motif结构域，因此本研究鉴定到的3个马铃薯StSERK1、StSERK3A和StSERK3B都是“RD” LRR-RLKs(图2).通过与拟南芥中的5个SERKs基因和其余5种农作物SERKs基因的进化树分析，StSERK1与AtSERK1和AtSERK2在同一分枝，而StSERK3A和StSERK3B与AtBAK1在同一分枝，而且同属于茄科的番茄SlSERK3A/3B，烟草NbSERK3A/3B和马铃薯StSERK3A/3B属于同一个分支(图1B).这些序列进化树分析结果也说明马铃薯和拟南芥SERKs家族基因具有类似的进化谱系.在马铃薯中鉴定到了与拟南芥BAK1同源的2个SERK基因StSERK3A和StSERK3B可能的原因在于本研究克隆用的马铃薯栽培种是同源四倍体作物，基因组高度杂合，染色体基因组来自不同倍性加倍而成，导致存在2个BAK1同源基因.而且在同科的烟草和番茄中也各自发现了2个拟南芥BAK1同源基因，但在马铃薯野生种(Solanumphureja，二倍体)中只鉴定到了1个拟南芥BAK1同源基因.大量的研究证据表明植物SERKs家族基因功能的多样性来自于蛋白质序列而非表达模式和水平，结构域交换的研究证据也表明SERKs基因胞外结构域和胞质结构域对SERKs家族基因功能多样性贡献更大[34].马铃薯SERKs和其他几个农作物氨基酸序列比对也发现，SPP结构域和C末端有更多的多态性，也符合Marije结构域交换的研究证据[34].3个马铃薯启动子表达组织分析发现，它们并不完全类同与拟南芥中的表达模式.StSERK1分别在真叶中有表达，果夹的顶端和基部有微弱的表达，而StSERK3A在真叶、果夹和花絮中都有很强的表达(图3).在拟南芥中，BAK1在发育各个阶段和组织中都强烈表达[29]，这与BAK1具有更多的功能相吻合.但马铃薯StSERK3B不论在叶，果夹和花絮中表达都要低于StSERK3A，可能的原因在于马铃薯StSERK3A/B都是BAK1的同源基因，在杂交过程中StSERK3A/B分别来自不同种的染色体，导致功能差异.而且在番茄SlSERK3A/B中也发现，沉默SlSERK3B而不是SlSERK3A导致番茄对PstDC3000的敏感性[21].

A:StSERKs的超表达对bak1-3 bkk1-1表型影响；B：转基因在bak1-3 bkk1-1中的表达；C：转基因蛋白在bak1-3 bkk1-1中的表达.A：Overexpression StSERKs can suppresses the phenotypes of bak1-3 bkk1-1；B：RT-PCR analyses to confirm the elevated expression of the transgenes in bak1-3 bkk1-1；C：Western blot analyses to confirm the elevated expression of the transgenic protein in bak1-3 bkk1-1.图4 StSERKs的超表达对bak1-3 bkk1-1的免疫自激活表型的影响(比例尺=1 cm)Figure 4 The auto-immune phenotypes of bak1-3 bkk1-1 are significantly suppressed in StSERKs overexpression lines(scale bar=1 cm)

A、B分别为台盼蓝和DAB染色(比例尺 = 200 um).A,B are trypan blue staining and DAB staining (scale bar = 200 um).图5 超表达StSERKs对bak1-3 bkk1-1的免疫自激活反应的抑制Figure 5 The auto-immune phenotypes of bak1-3 bkk1-1 are significantly suppressed in StSERKs Overexpression lines

图6 实时荧光定量RT-PCR对PR1、FMO1、SID2和EDS1的检测Figure 6 Real-time quantitative RT-PCR for detection of PR1,FMO1,SID2 and EDS1

BAK1和BKK1单个基因的缺失会降低PTI层面的免疫反应，导致bak1和bkk1单突感病；bak1-3bkk1-1双突缺失导致光诱导叶绿体形态建成后水杨酸爆发的细胞死亡表型，而迅速激活第2层ETI先天性免疫[30].SID2作为水杨酸合成途径的限速酶，EDS1作为ETI途径中的重要组分[35]，在拟南芥bak1-3bkk1-1背景下超表达马铃薯3个StSERKs都明显的降低了SID2和EDS1的表达，直接证明bak1-3bkk1-1激活的免疫活性被抑制.遗传学的结果也证明bak1-3bkk1-1体内水杨酸含量被降低.

4 结论

本研究通过同源序列比对从马铃薯基因组中鉴定到了3个SERKs家族基因.通过遗传、生理生化和分子水平证实3个马铃薯StSERKs是3个“RD” LRR-RLKs，具有类似拟南芥BAK1和BKK1参与先天性免疫的功能，在植物的免疫反应中发挥重要功能.