MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应

赵波，房永祥，贾怀杰，陈国华，何小兵，杨孝朴，景志忠

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070 ；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部兽医公共卫生重点实验室，甘肃 兰州 730046)

口蹄疫(food and month disease,FMD)是猪、牛、羊和其他偶蹄动物的高度传染性疫病，其致死率较低，但发病率很高，传播迅速，一旦发生疫情会给畜牧业带来严重的经济损失[1-2].目前该病主要流行于发展中国家，其防控措施主要是通过疫苗的免疫接种[3].但由于灭活疫苗免疫原性差，导致易感动物的免疫保护效果不太理想[4].王孝德等[5]分析了150头断奶育肥猪的口蹄疫O型免疫效果，结果显示1次免疫后28 d，抗体合格率为13%，2次免疫28 d后抗体合格率为30%，3次免疫28 d后抗体合格率才达到60%；陈一峰等[6]对120头仔猪抗体免疫合格率进行测定，1次免疫30 d后合格率只有60%，加强免疫后30、60、120 d抗体免疫合格率分别为91%、80%、62.5%.因此研发高效的口蹄疫灭活疫苗显得尤为重要.高效疫苗能够增强对易感动物的保护效果，减少免疫次数，降低生产成本，提前产生免疫能更好的阻断口蹄疫的暴发和流行.

成功的疫苗不仅有良好免疫原性的抗原，还包含高效激活免疫系统的佐剂.Toll样受体(Toll like receptors,TLR)的天然配体或合成的激动剂已作为潜在的新型免疫佐剂.例如CpG-ODN序列、单磷酰脂质A(MPLA)、鞭毛蛋白、R848、Poly-I-C等TLR受体的激动剂在很多疫苗中被广泛研究[7].单磷酰脂质A是TLR4受体的激动剂，它是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的脂质A的低毒性衍生物，其保留了母体分子的免疫活性的脂质A部分[8]，与LPS的区别在于，MPLA活化TLR4时优先募集TRIF，减少了炎性细胞因子的产生[9].因此，MPLA作为安全有效的免疫佐剂可与众多疫苗配伍，免疫增强各种疫苗的作用.如MPLA已用于人用疫苗中，预防HPV和HBV的感染[10-11]；MPLA和铝佐剂的联合，用于宫颈癌疫苗的佐剂[12]；MPLA用作流感疫苗的佐剂可降低抗原的使用量，且增强了免疫力低下老年人群的抵抗力[13]；MPLA应用于狂犬病疫苗，促进了抗体的产生[14].然而，MPLA用于口蹄疫疫苗佐剂的研究还鲜有报道.本研究首先在体外对MPLA的免疫刺激作用进行了分析，然后将其与ISA 206和口蹄疫O型灭活病毒抗原配伍制成疫苗后免疫小鼠，探讨了MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应.

1 材料与方法

1.1 试验材料

SPF级C57BL6小鼠，6～8周龄，雌雄各半，60只，购于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心.

RPMI 1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、β巯基乙醇均购于Gibco公司；红细胞裂解液购于天根科技有限公司；GM-CSF和IL4购于R&D；MPLA-SM VacciGradeTM购于Invivogen公司；CD16/32、CD3-PE、CD4-PE、CD8-APC、CD19-APC、CD11c-FITC、CD11c-FITC 、CD40-PE、CD80-APC、CD83-PE、CD86-PerCP、MHCⅠ/Ⅱ-Per-CP、CD27-FITC、CD38-PerCP等流式抗体购于BD公司；O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测试剂盒购于中农威特生物科技股份有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 体外刺激B细胞增殖 在无菌间将C57BL6小鼠颈椎脱臼处死后，酒精浸泡，取脾脏，用5 mL注射器的活塞将脾脏块在滤网上研磨直到仅剩纤维组织.1 500 r/min离心5 min后弃上清，加入2～3 mL红细胞裂解液，裂解5 min.加入3倍体积的PBS，再次离心.重悬细胞，并加入CFSE染料(终浓度为5 nmol/L)，37 ℃、10 min(期间震荡2～3次)，冰浴5 min，用PBS洗涤3次，重悬，计数，以1×106/孔铺板，并用MPLA 0.45 μg/mL刺激.设置阴性、阳性、单阳性和试验组，试验组和阴阳性对照各做3个复孔，37 ℃、5% CO2培养箱培养3 d后收细胞，1 500 r/min离心5 min，弃去上清，沉淀细胞用PBS洗涤1次.加入100 μL PBS悬浮细胞后，加入CD16/32室温避光封闭5 min，再加入抗体CD19-APC，4 ℃避光孵育30 min.PBS洗涤1次，用流式细胞仪检测.

1.2.2 体外刺激DC成熟 无菌分离C57BL小鼠骨髓细胞，在浓度20 μg/mL GM-CSF和10 μg/mL IL-4的10% FBS的1 640培养基中培养，第3天进行半量换液[15-16].第6天收集细胞，用PBS洗涤1次，然后计数，以1×106/孔铺板，做3个复孔，MPLA 0.45 μg/mL刺激，设置阴阳性对照(300 μg/mL工作浓度的LPS用作阳性对照).培养24 h后，收集细胞，用流式细胞仪检测DC细胞MHC分子和共刺激分子的表达情况.

1.2.3 刺激成熟DC吞噬能力的检测 将上述培养成熟的DC以1×106/每孔铺板，并做3个复孔，用MPLA 0.45 μg/mL刺激，并设置阴阳性对照(300 μg/mL工作浓度的LPS用作阳性对照).培养24 h后，收集细胞加入流式抗体CD11c-APC，一分为二，并加入Dextran-FITC，1份置于4 ℃，1份置于37 ℃，孵育1 h，用PBS洗涤3次后用流式细胞仪检测.通过平均荧光密度来计算吞噬能力.即吞噬的粒子为37 ℃的平均荧光强度值减去4 ℃的平均荧光强度值[17].

1.2.4 疫苗的制备与免疫接种 将ISA 206与MPLA(5 μg/只)、O型FMDV灭活抗原(2 μg/只)和生理盐水等体积混合，并用乳化仪以5 000 r/min乳化2 min，静置2 min，反复5次.对乳化好的疫苗进行稳定性测试，用配制好的疫苗以200 μL/只的剂量肌肉注射免疫小鼠(左右后腿部位分别注射100 μL)，每组免疫15只小鼠.

1.2.5 免疫小鼠抗体的检测 O型口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测免疫前后0、7、14、28、42、60 d的小鼠血清中抗体效价.先用不同稀释度的待检血清与等体积标准抗原于4 ℃过夜；加入50 μL反应液于包被口蹄疫O型灭活病毒抗原的板上，37 ℃反应1 h，洗板3次；加入口蹄疫O型灭活病毒抗原豚鼠抗体反应30 min，洗板3次；加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，37 ℃反应30 min，拍干；加入TMB底物A-B混合液，37 ℃反应15 min；加入终止液，在酶标仪上读取OD450值.

1.2.6 脾脏细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的检测 免疫后第28天，每组取5只小鼠的脾脏，研磨制备脾细胞液，并用红细胞裂解液裂解红细胞，收集细胞沉淀，计数，以1×106个细胞在100 μL体系中染色.加入CD16/32，室温避光封闭5 min；加入抗体CD3-PE、CD4-PE和CD8-APC，4 ℃避光孵育30 min；加入1 mL PBS洗涤1次，加入400 μL PBS，用流式细胞仪检测T细胞.

1.2.7 抗原特异性B细胞的检测 免疫后第28天，每组取5只小鼠的脾脏，研磨制备脾细胞液，并裂解红细胞，收集沉淀.用5 μmol/mL的CFSE进行染色，计数.以1×106/孔铺板，每只小鼠做3个复孔，用与免疫小鼠相同的灭活O型口蹄疫病毒抗原2 μg/mL刺激，并且用300 ng/ml LPS作为阳性对照，培养3 d，收集细胞加入CD19-APC标记B淋巴细胞，用流式细胞仪检测抗原特异性B淋巴的增殖情况.

1.2.8 外周血中浆细胞比例的检测 小鼠免疫后第60天，每组取5只采集外周血，并用3.8%的柠檬酸钠抗凝.取100 μL血液，加入CD19-APC、CD27-FITC、CD38-PerCP流式抗体，室温下放置15 min，再加入1 mL的红细胞裂解液，裂解9 min，1 500 r/min离心5 min，收集细胞；加入1 mL PBS洗涤1次，同样转速收集细胞；加入400 μL PBS，用流式细胞仪对小鼠外周血液中的浆细胞进行检测，每只小鼠做2个重复.

1.3 数据处理

使用BD Accuri C6 Plus 流式细胞仪进行数据的收集和处理，GraphPad Prism 6和IBM SPSS Statistics 22进行作图和数据处理.

2 结果与分析

2.1 MPLA体外刺激B淋巴细胞的增殖

为探究MPLA在体外刺激B淋巴细胞增殖的能力，用MPLA 0.45 μg/mL体外刺激小鼠脾脏细胞[18]，发现MPLA显著刺激了B淋巴细胞的增殖，如图1所示.

2.2 MPLA刺激DC成熟

为探究MPLA的刺激DC成熟的能力，用MPLA 0.45 μg/mL刺激DC，发现MPLA显著提高了DC共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86的表达，表明MPLA在体外具有较强激活DC成熟的能力，如图2所示.

图1 MPLA体外刺激B淋巴细胞的增殖Figure 1 MPLA stimulated B lymphocyte proliferation in vitro

2.3 MPLA刺激成熟DC的吞噬能力

为了探索MPLA刺激DC后的吞噬能力，用DC与dextran-FITC孵育并测定了DC吞噬dextran-FITC的能力，发现MPLA刺激后的DC相对于未处理的DC，其吞噬能力显著减弱，说明MPLA在体外具有刺激DC成熟的能力，如图3所示.

2.4 佐剂与疫苗的稳定性

疫苗的稳定性直接影响疫苗的质量[19].为检测疫苗的稳定性，将乳化好的疫苗吸1滴，滴在水中，观察其在水中是分散情况，结果发现疫苗滴在水中静置10 min不散开.同时，将制备好的疫苗放置在4 ℃冰箱中静置4个月，未出现分层现象，如图4所示，说明疫苗的乳化效果良好.

2.5 抗体的效价

为检测MPLA对FMDV疫苗刺激抗体产生的影响，对1次免疫后的小鼠在0、7、14、28、42、60 d测定血清抗体效价，结果如图5所示.发现MPLA+ISA 206+FMDV相对于ISA 206+FMDV在第7天和第14天时显著提高了抗体水平，差异极显著；在第28天和第42天抗体水平仍高于疫苗对照组，但差异不显著.

图3 MPLA刺激后对DC抗原摄取能力的影响Figure 3 The capacity of DC for antigen uptake after stimulated by MPLA

图4 乳化后的FMDV灭活疫苗Figure 4 Emulsified FMDV inactivated vaccine

2.6 脾脏细胞中T细胞的检测

细胞免疫在获得性免疫应答中发挥重要作用，细胞免疫主要由T淋巴细胞介导.免疫后28 d，分离脾脏细胞，检测CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的比例.结果如图6所示，MPLA未能提高小鼠脾脏中这两种细胞的比例.

A:流式细胞仪检测结果；B:3次独立试验结果.A:Flow cytometry test results；B:Results of three independent experiments.图2 MPLA刺激DC后共刺激分子及MHC分子的表达Figure 2 The expression of co-stimulatory molecules and MHC molecules after DC was stimulated by MPLA

图5 免疫小鼠后各时间点抗体的效价Figure 5 Antibody titer at various time points after mice were immuned

A:CD3+CD8+T细胞；B:CD3+CD4+T细胞.A：CD3+CD8+ T cell；B：CD3+CD4+ T cell.图6 免疫后28 d脾脏中T淋巴细胞亚群的比例Figure 6 The comparison of T cell content in spleen at 28 day after immuned

2.7 脾脏中抗原特异性B细胞的增殖

免疫后小鼠脾脏中淋巴细胞的增殖可以反映抗原特异性淋巴细胞反应的强度[20].免疫后28 d，分离脾脏细胞，检测抗原特异性淋巴细胞增殖能力.结果如图7所示，MPLA+ISA 206+FMDV组的抗原特异性B淋巴细胞增殖比例显著高于ISA 206+FMDV组，差异极显著(P<0.001).表明MPLA具有显著促进脾脏抗原特异性B细胞增殖的能力.

2.8 外周血中CD19+CD27+CD38+浆细胞的检测

浆细胞是B淋巴细胞发育的最终阶段，能分泌抗体而发挥体液免疫的作用[21].流式细胞术检测免疫后60 d外周血中浆细胞的百分率，结果如图8所示.MPLA+ISA 206+FMDV组血液中的CD19+CD27+CD38+浆细胞的百分比显著高于ISA 206+FMDV组(P<0.001)，表明MPLA佐剂能显著增强B细胞增殖，提高外周血中浆细胞的比例.

图7 抗原特异性B细胞增殖Figure 7 Antigen-specific B cell proliferation

图8 免疫后60 d外周血中浆细胞含量的比较Figure 8 The comparison of plasma cell content in peripheral blood at 60 day after immuned

3 讨论

口蹄疫是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其传播迅速、难于防治，严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易.疫苗接种是目前预防FMDV的有效和可靠手段，而常规的FMD灭活疫苗是当前免疫接种的最为主要的疫苗类型.然而，常规灭活疫苗免疫效果不甚理想，抗体产生期较晚且持续期较短，接种动物机体后产生较大的毒副作用，如肉芽肿，脓肿等，严重影响了动物机体的健康和食品安全.因此，开发更为安全有效的疫苗迫在眉睫，而研制高效的免疫佐剂是研发高效疫苗的关键环节之一.

TLRS的配体作为免疫佐剂受到研究人员的广泛关注，这些配体具有激活天然免疫细胞的能力，可非特异性的增强机体对抗原的免疫应答[22].MPLA作为TLR4的配体，可显著增强T和B细胞的免疫应答水平[23]，将其作为免疫佐剂已在诸多疫苗中进行了免疫增强效应的评价，并与部分疫苗配伍成功应用于临床实际中.本研究在体外探讨了MPLA的免疫刺激作用，并与ISA 206和口蹄疫O型灭活病毒抗原配伍制成疫苗免疫小鼠，评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应.

抗体的产生在保护机体免受病原微生物感染中具有重要作用，同时，检测抗体产生的水平也作为评价疫苗免疫效果的一项重要指标.高效的疫苗能激活持久的免疫力，诱导高水平抗体的产生，能及时保护被免动物，达到早期控制疫情的目的[24].本试验中，我们检测了免疫后第7、14、28、42、60天的抗体水平，试验结果表明MPLA组在免疫后第7、14天时，抗体水平显著高于ISA 206对照组(P<0.01).这是因为TLR4位于细胞表面，而MPLA作为TLR4的配体，通过活化TLR4激活一系列免疫反应事件而调节获得性免疫反应.TLR4介导的DC成熟能上调共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD70的表达，并增加IL-6和TNF等细胞因子的产生.IL-6与B细胞的生长发育及活化有关，CD70能通过B细胞调节抗体的产生.因此，MPLA通过活化TLR4，增加了共刺激分子和MHC分子的表达，进而增加了疫苗抗体水平的产生.此外，MPLA组在第7、14天时就已产生较高滴度的抗体水平，说明MPLA可作为口蹄疫紧急接种类疫苗的免疫佐剂，提前抗体产生的时间点并提高抗体水平.MPLA作为狂犬病灭活疫苗的佐剂，增加了免疫后前10 d的抗体水平[14].试验结果与该结果一致，说明MPLA作为免疫佐剂，可提前抗体产生的时间点，因而可作为紧急接种类疫苗的候选免疫佐剂.

淋巴细胞在获得性免疫中发挥着至关重要的作用，而T细胞的免疫应答反应是机体产生免疫反应的关键.T细胞根据其表面分子表达的的不同，而分为CD4+和CD8+T细胞，其中CD4+T细胞主要介导Th免疫应答，通过促进B细胞的成熟活化，增强机体的体液免疫；CD8+T细胞主要介导细胞免疫，杀伤靶细胞[26].本试验通过流式细胞技术检测抗原特异性淋巴细胞增殖以及外周血中浆细胞的比例.结果发现，MPLA组显著促进了抗原特异性的B淋巴细胞增殖及外周血中浆细胞的比例(P<0.001).Poteet等[28]将MPLA作为HIV病毒样颗粒疫苗的佐剂，发现增加了生发中心B细胞以及CD8+T细胞的比例；Moon等[28]将MPLA加入到含铝盐的乙肝疫苗中，增强了细胞免疫和体液免疫.试验结果表明，MPLA在小鼠中增强了B淋巴细胞的增殖活化，并进而促进了体液免疫应答.

4 结论

MPLA添加到口蹄疫O型灭活疫苗中免疫小鼠，可以促进小鼠在免疫反应前期的抗体产生水平，促进B淋巴细胞的增殖与活化，提高机体中浆细胞的比例，因而MPLA可作为口蹄疫疫苗良好的候选免疫佐剂.