牛肝血布丁酶解条件优化及储藏期品质检测

李丙子，韩鋆，吴仕逹，邰晶晶，黄国业，余群力，张玉斌

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.榆中兴业种养殖公司，甘肃 兰州 730070)

我国是一个畜牧业生产大国，肉牛生产总量位居世界前列.在2017年末我国牛头数达5 230万头[1].在屠宰过程中脏器约占牛总体重的8.47%，并且随着我国养牛产业的迅速发展，牛副产物也在逐年增加[2-3]，同时每年屠宰也可获得57.25万t牛血[4]，牛血中含水量为591.86 g/kg，血红蛋白316.74 g/kg，干物质408.14 g/kg，胆固醇3.379 g/kg，磷脂酰胆碱为3.748 g/kg，牛血的组成与肉相近，而血中铁的含量是肉的10倍[5-6]，此外牛血中还含有适量的钙、磷、铁、锰、锌等矿物质以及硫胺素、核黄素、泛酸等生理活性物质[7]，牛肝是牛的重要器官之一，牛肝中含有丰富的活性物质如：左旋肉碱、牛磺酸、谷胱甘肽、维生素A等，牛肝中维生素A远超于其他畜产制品[8-11].已有研究表明牛肝中的活性物质具有很重要的生理和保健功能[12-13].长期以来，企业对其加工利用仅仅止于血豆腐等常见的加工制品，造成很大的浪费，且据环保部门统计，每年最少使用1亿元防止废弃血液造成污染[14].此外，布丁产品的原料局限较大，血布丁还处于待开发研究阶段，为了丰富血布丁种类，填补国内技术空白，本文以牛血为原料，参考瑞典血布丁加工配方[15]，系统的对其加工工艺进行了研究，在为工业化生产提供理论依据的同时，提高牛副产物的利用价值，同时为消费者提供营养均衡、风味独特地新型血布丁.

在牛肝血布丁加工过程中由于牛肝有很重的腥味，并不被人们所接受，有研究发现酶作用于蛋白质能形成食品的特有风味[16]，并且水解后产生的小分子蛋白和多肽能提高产品的营养价值，酶的本质是蛋白质，降解后形成的氨基酸可被人体吸收利用，因此酶解法在肉类食品加工中将起着越来越重要的作用[17].所以选用风味蛋白酶改善牛肝风味.

牛肝血布丁工艺转化到商品市场，不仅有利于填补国内技术空白，将血布丁这种国外食品推广到我国，而且在国家大力倡导发展循环经济、提倡节能减排的背景下，将畜禽加工中的副产物合理转化，既避免了污染，同时大大提高了宰后副产物附加值，争取了最大经济效益.通过研究开发出一种富含营养、食用方便的休闲食品，丰富了血布丁种类，拓宽了牛副产物制品的发展途径.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验牦牛来自甘肃康美现代农牧产业集团有限公司，随机选择发育正常、健康无病、12月龄的15头肉牛牛血和肝脏为试验材料，宰前禁食24 h，禁水2 h，宰后将全血收集在标有编号的贮藏罐内，在-20 ℃下保存备用.风味蛋白酶；无锡市雪梅酶制剂科技有限公司，酶活力≥20 U/mg.

牛奶，牛油，大麦粉，燕麦粉，大豆分离蛋白，淀粉，食盐，洋葱油，姜汁，白胡椒汁，卡拉胶，均为市售食品级.

瑞典血布丁配方：猪血，牛奶，牛脂，大麦粉，淀粉，洋葱油，糖，盐.

1.2 仪器与设备

SLD-320打浆机,山东省曲阜市圣鲁机械厂；JCG蒸煮锅,温州扬名机械有限公司；AYJ-LG-ZT真空采血机,广州市安亦捷有限公司；FYL-YS-280L血液贮藏罐,诸城良工机械有限公司；CR-10色差仪,日本柯尼卡美能达公司；JY92-ⅡDN HHS型恒温水浴锅,北京科伟永兴仪器有限公司；TA-XTC质构仪,上海保圣实业发展有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 牛肝血布丁工艺流程及操作要点

1.3.1.1 牛肝血布丁工艺流程 原料预处理→牛奶预热→混合溶解→混料、搅拌→配制调料、加牛肝浆→拌料→成型蒸煮→冷却包装→微波杀菌→成品

1.3.1.2 操作要点 原料预处理：取经检疫合格的牛血、牛肝.将牛肝解冻冲洗，去掉脂肪、筋腱等组织，打浆过滤后，加入风味蛋白酶进行酶解.

牛奶预热：后将牛脂切丁后浸入到鲜牛奶中预热，不断搅拌直至牛脂溶解.

混料调配：牛奶进行自然降温后，和酶解好的牛肝浆一起加入鲜牛血中，再添加调料与香辛料(姜汁、盐等)，充分搅拌均匀，最后将大麦粉、燕麦粉等风味改良剂缓缓加入，边加边搅拌，直至均匀无结块.

成型蒸煮：在模具内涂抹上植物油，将上述混合糊状物注入模具中，移入蒸煮锅内，蒸煮至按压有硬芯感.

冷却包装：出锅后快速冷却，以热收缩袋进行真空包装，后置于恒温水浴锅进行热水收缩处理.

微波杀菌：采用频率为2 450 MHz，功率750 W的微波进行杀菌，将样品取出降温冷却至20 ℃，即得牛肝血布丁产品.

1.3.2 单因素及响应面试验设计

1.3.2.1 风味蛋白酶改善牛肝风味单因素试验 风味蛋白酶水解条件的单因素试验：在风味蛋白酶水解过程中发现，酶用量、酶解温度、初始pH对风味蛋白酶的酶解度影响很大，分别在酶用量为5%、酶解温度为55 ℃、初始pH6的条件下，固定其他条件不变，设置酶用量(3%、4%、5%、6%、7%)、酶解温度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)、初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，以酶解度为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.3.2.2风味蛋白酶改善牛肝风味响应面试验 利用响应面法优化风味蛋白酶水解条件：在单因素试验的基础上，根据Box-Behken试验设计方案，选取酶解温度、酶解pH和酶用量为3个因素获得最优酶解条件，以游离态氨基酸氮含量为响应值，通过响应曲面分析(response surface analysis，RSA)进行酶解条件的优化.试验因素与水平设计见表1.

表1 Box-Behnken试验因素水平表

1.3.3 牛肝血布丁贮藏过程中品质变化 游离态氨基酸氮测定：参考于桂花的方法[18]并略作修改.吸取酶解液5 mL，置于100 mL的容量瓶中，混合均匀后吸取20 mL，往烧杯加入60 mL水，搅拌，再用0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，当酸度计读数为pH8.2时，加入10 mL中性甲醛溶液，搅拌均匀，用0.05 mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH 9.2，记下毫升数Vl.

试剂空白：取80 mL水，先用0.05 mol/L的氢氧化钠溶液调节至pH 8.2，再加入10 mL中性甲醛溶液，用0.05 mol/L氢氧化钠滴定至pH 9.2，记下毫升数V2.按下面公式计算游离态氨基酸态氮含量.

式中，X为试样中氨基酸态氮的含量，g/100 mL；V1为试样消耗的氢氧化钠标准液量，mL；V2这空白样消耗的氢氧化钠标准液量，mL； 0.014为氮的毫克当量.

1.3.4 营养成分测定方法 水分含量的测定：参照《食品中水分的测定GB 5009.3-2016》[19]；蛋白质含量的测定：参照《食品中蛋白质的测定GB 5009.5-2016》[20].

1.3.5 产品货架期品质变化 将制作完成的牛肝血布丁置于(4 ℃)的冰箱保藏，每隔7 d进行1次检测，并做好相应的数据记录.

1.3.5.1 色差变化 用色差计测定牛肝血布丁表面的L*值、a*值和b*值.每组3个平行样，每块牛肝血布丁测定3次，取其平均值.

1.3.5.2 质构变化 本试验将牛肝血布丁产品切成10 mm×10 mm×10 mm正方体，使用P50探头.测定过程中的技术参数为：测前速度1 mm/s，测中速度5 mm/s，测后速度5 mm/s，压缩比为75%.每次测试重复6次.

1.3.5.3 含水量的变化 参照《食品中水分的测定GB/T 5009.3-2016》采用直接干燥法测定[19].

1.3.5.4 菌落总数的变化 菌落总数测定方法参照《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB4789.2-2016》中的平板菌落计数法测定[21].

1.3.5.5 感官品质变化 感官品质的评价如表2所列.

表2 感官评价表

1.3.5.6 挥发性盐基氮的测定(TVB-N) 参照《食品中挥发性盐基氮中半微量定氮法GB/T 5009.228-2016》测定[22].

1.3.5.7 硫代巴比妥酸值(TBARS)的测定 参照《食品中丙二醛的测定方法GB/T 5009.181.2016》[23].

2 结果与分析

2.1 风味蛋白酶单因素试验结果与分析

2.1.1 风味蛋白酶水解条件单因素 由图1可知3种影响影响因素对酶解量的变化呈现出高度的一致性，呈现出先上升后下降的趋势.酶用量在3%～5%之间，随着酶用量的增加酶解度呈现上升趋势，在酶用量5%～7%之间随着酶用量的增加，酶解度出现下降，可知酶解度在酶用量为5%时达到最大值，故酶用量5%最佳.酶解度随着酶解温度的升高而呈现先上升后下降的趋势，当酶解温度45～50 ℃之间酶解度呈缓慢增长趋势，温度在50～55 ℃之间酶解度增长迅速并且在55 ℃到最大值，在55 ℃以后，酶解度开始逐渐下降，这是由于酶的催化作用只有在一定温度下才能表现出来，温度升高到一定限度时，酶活力钝化[24]，直至丧失，选择酶解温度为55 ℃.酶解度在初始pH为4～6时，酶解度随着pH的增加而增大，而当pH增大到6时，继续增加pH值，酶解度呈现下降趋势，这是因为酶的活性在一定的pH时酶活性较强，酶解度在pH值为6时达到了最大值，因此选择初始酶解pH为6.

图1 酶用量对酶解度的影响Figure 1 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis

图2 温度对酶解度的影响Figure 2 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis

图3 初始pH对酶解度影响Figure 3 Effect of initial pH on enzymatic hydrolysis

2.1.2 风味蛋白酶的响应面分析法优化工艺结果与分析 对酶用量、酶解温度和酶解pH进行三因素三水平的响应面分析，中心旋转组合试验方案及试验结果见表3.

根据表3的试验结果，采用Design Expert 8.0软件进行回归分析，通过响应面回归方程进行数据分析并得出回归模型，得到三元二次回归方程式：Y=9.36+0.22X1-0.065X2+0.23X3-0.06X1X2+0.022X1X3-0.65X2X3-0.78X12-0.19X22-0.57X32式中：Y为酶解度，X1为酶解温度，单位为℃；X2为酶解pH，X3为酶用量，单位为g.

表3 响应面分析试验及结果

由表4可知，建立的此回归模型具有显著性，自变量(酶解温度、酶用量、初始pH值)与响应值(酶解度)之间的线性关系显著，模拟失拟项不显著(P>0.05)，失拟项F=0.62，说明试验误差小，失拟项对模型的纯误差影响不显著，以上回归方程与试验数据有很好的拟合，可用于风味酶酶解度试验的理论依据.方程一次项(酶解温度X1和初始pH值X3)、交互项(X1X2、X2X3)都是极显著的影响(P<0.01)，交互项(X1X3)为显著影响(P<0.05)，因此各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，其决定系数R2=0.9731，模型F=0.000 1，这表明该模型和实际的试验拟合比较好，说明试验因子对模型总体影响显著，同时试验值与预测值是非常接近的，通过方差分析，表明影响酶解度效果的三因素大小顺序为初始pH值(X3)、酶解温度(X1)、酶用量(X2).

表4 回归模型方差分析及其系数的显著性试验

酶解温度、酶用量、初始pH值这3个因素，两两交互作用，对其作响应面，如图4所示，从响应面可以直接观察出各试验因素对响应值的影响大小.当响应面坡度非常的陡峭，说明该因素的改变对酶解度非常敏感，反之，若响应面坡度相对平缓，表明酶解度在该因素上变化时影响较小.采用Design Expert 8.0软件进行数据处理，得到了最大酶解度时的配比，通过对回归模型进行数学分析可知当：初始pH 5.54、温度53.19℃、酶用量4.93%时，酶解度为9.76 g/100 mL，为风味酶最佳酶解条件.

2.1.3 最佳加工条件及验证 运用Design ExpertV 8.0软件，得出牛肝血布丁制作最佳工艺条件.即风胃蛋白酶添加量为5%、温度为55 ℃、初始pH为6.在此条件下试验所得牛肝血布丁的感官评分为90.23.考虑到操作的可行性，最优提取参数调整酶添加量为4.93%、温度为53.19 ℃、初始pH为5.54.代入拟合方程，计算得出牛肝血布丁感官评分为90.43.与理论值非常接近.

2.2 牛肝血布丁各种营养成分含量

由上表5可知牛肝血布丁是一种高蛋白低脂肪的休闲食品，其中添加了大麦、燕麦等多种粗纤维成分，可以有效平衡热量，更具功效.此外，该产品添加了富含易于人体吸收铁的牛血和牛肝2种牛副产物作为主要原料，与郭宗林[25]等制作的单一牛肝酱相比铁含量以及蛋白质含量更高.使其成为一种富铁食品.

图4 响应面优化曲面Figure 4 response surface optimization surface map

表5 营养成分表

2.3 货架期品质变化

2.3.1L*、a*和b*值的变化L*值在0～7 d变化不明显(图5)，在7～14 d内L*下降明显，可能由于牛肝血布丁中蛋白质发生分解导致该产品亮度发生明显变化[26].在14～28 d贮藏过程中L*值物明显变化，先缓慢下降后略有升高，在第28 d以后，L*发生第二次明显下降，由初值48.6下降至41.3，这可能是由于随着贮藏时间的增加，牛肝血布丁中的蛋白质再度发生分解[27].在贮藏一周后a*值直线下降(图6)，出现最低值，在7～21 d内牛肝血布丁a*值变化不明显，先上升后下降，说明在这段贮藏期内牛肝血布丁的a*值无太大变化，当保藏到第21 d时a*值有所上升，上升至9.8后持续上升但变化不大.由图7可知牛肝血布丁在放置到7 d时b*值显著增髙，在7～21 db*开始下降，当贮藏至21 d时，出现最低值，b*下降至11.6，此后随着贮藏期的延长b*值开始上升，在28 d后b*值上升但变化不明显.

图5 贮藏时间与L*值变化Figure 5 Storage time and L* value changes

图6 贮藏时间与a*值变化Figure 6 Storage time and a* value changes

图7 贮藏时间与b*值变化Figure 7 Storage time and b* value changes

2.3.2 质构变化 牛肝血布丁产品的质构随时间的增加变化不同.牛肝血布丁的硬度随着贮藏时间的延长(图8)，整体呈上升趋势，在28 d达到最大值，硬度受水分影响较大[28]，随着牛肝血布丁内部水分变化，硬度发生变化，贮藏期水分流失越多，牛肝血布丁硬度越大，影响产品口感，使产品口感欠佳.胶着性在数值上用硬度和黏聚性的乘积表示[29].在保藏期内牛肝血布丁的胶着性呈上升趋势，说明贮藏时间越长牛肝血布丁的黏性越大，与硬度变化趋势相似.在35 d胶着性达到最大，可能是由于随着牛肝血布丁水分含量的减少，硬度增加，胶着性增加.在贮藏过程中弹性值随着时间增长逐渐增长，表明压缩后牛肝血布丁的结构被破坏，研究发现牛血浆蛋白与肉蛋白相互作用，能形成较大分子的凝胶体，它是一种致密的三维网络结构[30]，结构破坏后提高恢复程度.在贮藏的前21 d内弹性明显上升，在21 d后弹性并无明显变化.随着贮藏时间增加，咀嚼性呈现上升的趋势，咀嚼性越强，牛肝血布丁越难被嚼碎，在第35 d时咀嚼性达到最大，这可能是由于随着贮藏时间的延长，牛肝血布丁的水分含量降低，进而嫩度降低导致其咀嚼性增加.在0～14 d内牛肝血布丁的回复性呈现上升的趋势，之后有所下降，但变化不明显，在第21 d以后又有所上升，这种变化趋势可能与牛肝血布丁产品的结构特点有关[31].感官评定发现，回复性会在一定程度上影晌牛肝血布丁的品质，回复性较好的产品口感较好[32].

图8 贮藏时间与硬度变化Figure 8 Storage time and hardness changes

图9 贮藏时间与胶着性变化Figure 9 Storage time and stalemate sex change

图10 贮藏时间与弹性变化Figure 10 Storage time and elastic changes

图11 贮藏时间与咀嚼性变化Figure 11 Storage time and chewiness changes

图12 贮藏时间与回复性变化Figure 12 Storage time and the irreversible change

2.3.3 水分含量的变化 由图13可知随着贮藏时间的延长，牛肝血布丁的含水量呈下降趋势.这可能是由于物料受热时间太长，使蛋白质结构发生变化，水合力低弱形成脱水[33]，水分含量下降趋势呈现逐渐下降趋势，这可能与牛肝血布丁是真空密封包装的，水分不容易流失，所以水分损失不明显[34].牛肝血布丁的水分含量是影响其食用品质的重要因素，它不仅影响了产品的质构变化，也影响了其微生物的生长繁殖状况[35].

图13 贮藏时间与含水量变化Figure 13 Storage time and moisture content changes

2.3.4 微生物指标的变化 由表6可知，发现随着贮藏时期的延长，菌落总数随着时间的增加而增加，这可能与牛肝血布丁中水分的迁移有很大关系，高湿为微生物生长提供了理想条件[36].牛肝血布丁在4 ℃保藏条件下32 d之后卫生指标不符合国家标准，超出国家规定5×104CFU/cm2，由此牛肝血布丁的保质期初步可设定为32 d.

2.3.5 TVB-N变化 由图14可知，随着贮藏时间的增加的，产品的TVB-N值持续上升，且在30 d时达到25 mg/100g，相关研究表明，以TVB-N值<25 mg/100g时为产品货架期的时间[37]，挥发性盐基氮的值说明微生物对产品中蛋白质的氧化程度[38].图中随着贮藏时间的增加TVB-N值持续上升，但是在0～10 d时增长缓慢，这可能时由于高温杀死部分微生物，产品在贮藏初期微生物较少.王天佑[39]研究发现，肉制品经较长时间和较高温度煮制后会使内源酶失活，因此在贮藏中TVB-N一般是由微生物及其分泌的酶相互作用而产生的.当微生物达到一定量后会使产品的TVB-N值迅速增加，Zogul[40]对沙丁鱼在不同包装下的化学、微生物等研究中，其TVB-N值的变化与本研究相同，从图中可以看出在30 d时接近25 mg/100g，可以大致判定产品的货架期为30 d.

表6 牛肝血布丁货架期间菌落总数变化

图14 贮藏时间内TVB-N的变化Figure 14 Storage time and TVB-N changes

2.3.6 TBARS变化 如图15所示，TBARS随着贮藏时间的增加呈现出增长的趋势，Wood[41]对牛、羊脂肪对肉及肉制品的研究发现当TBARS值高于1.0 mg/kg时，会产生酸败的气味，宋艳艳等[42]对传统风干牦牛的研究中TBARS的变化与本试验相同，李梦琪[43]在研究欧拉藏羊的脂肪氧化中，TBARS的变化趋势也与本研究相同.由图中可知在当贮藏时间在30d时TBARS值接近于1 mg/kg，因此可以的确定货架期为30 d.

2.3.7 感官品质变化 由图16可知产品初始感官评分为85分，总体感官评分一直处于下降趋势，随着时间的延长感官品质越来越低，当贮藏到28 d时，牛肝血布丁表面变得比较硬，出油，风味减弱，组织结构变得粗糙，出现小孔，产品色泽暗红口感变差，超出人们能接受的范围.

图15 贮藏时间内TBARS的变化Figure 15 Changes in malondialdehyde during storage

图16 贮藏过程中牛肝血布丁感官评分变化Figure 16 Storage time and sensory characteristics changes

3 讨论

有研究发现酶作用于蛋白质能形成食品的特有风味[16].本实验在风味蛋白酶改善肉类风味的研究基础上，通过响应面设计进行优化试验，结果表明酶解度的不同，是由于其酶解温度、pH、酶添加量3种因素决定的[44]，温度对酶解度的影响主要体现在酶的催化作用只有在一定温度下才能表现出来，温度升高到一定限度时，酶活力钝化[45]，王艺伦等[46]研究发现各因素对酶解度的产生最大的影响是酶解温度，孟月志对胃蛋白酶的性质研究发现，酶在特定的条件具有较高活力[47]，本研究发现当风味蛋白酶在温度、pH、酶添加量达到一定条件时酶解度最高，与上述研究结果相吻合.

影响牛肝血布丁货架期品质变化的的因素很多，其中酶的作用是主导因素，而生物化学反应主要体现在以影响产品外观、口味和风味为主的氧化反应上[48].同时水分含量也是影响产品货架期的一个重要因素，它不仅影响了产品的质构变化，也影响了其微生物的生长繁殖状况[35].内部水分迁移导致了牛肝血布丁色差和质构的各项指标的变化，刘恩岐[33]研究发现发酵布丁在贮藏期间，随着贮藏时间的增加水分含量降低其硬度增加，赵兰[26]在对琼胶大豆牛奶布丁研究中发现储藏在40 ℃条件下的亮度L*均随着时间的延长而减小，本研究结果与上述相符.说明在牛肝血布丁保藏工作中最主要还是控制水分的流失.食品腐败变质是由于酶、微生物和外界环境等的共同作用使得食品在贮藏、加工和流通等过程中品质下降，产生不良气味，进而货架期缩短[49].其中微生物活动是引发食品腐败的主要原因.大量研究发现，食品在加工流通过程中腐败变质是由于部分优势菌大量增殖的结果，这些优势菌包括特定腐败菌(specific spoilage organisms，SSO)，产生腐败代谢产物(臭味、异味、颜色等)，还包括不产生腐败代谢产物的细菌[50].在贮藏初期，SSO数量和比率可能不高，但对特定贮藏环境的忍耐能力强、生长繁殖快，腐败活性强[51].目前主要采用微生物检测手段和理化分析进行货架期品质变化评价[52]，这种评价方法仅仅反应产品微生物和理化指标是否合格，但是不能很好的体现消费者对产品的接受度以及消费者期望的产品质量特性要求.对于很多易腐败的产品和半易腐败的产品，感官评价是确定货架寿命的关键因素，产品品质变化往往通过消费者的描述性分析和接受度来体现.如鲜肉品质变化过程中会产生消费者易于识别的感官特性变化，色泽损失和异常气味等，这是由细菌活动和快速的化学氧化反应所引起的品质下降[53].挥发性盐基氮的值说明微生物对产品中蛋白质的氧化程度[38].图中随着贮藏时间的增加TVB-N值持续上升，但是在0～10 d时增长缓慢，这可能时由于高温杀死部分微生物，产品在贮藏初期微生物较少.王天佑[39]研究发现，肉制品经较长时间和较高温度煮制后会使内源酶失活，因此在贮藏中TVB-N一般是由微生物及其分泌的酶相互作用而产生的.当微生物达到一定量后会使产品的TVB-N值迅速增加，Zogul[40]对沙丁鱼在不同包装下的化学、微生物等研究中，挥发性盐基氮随着贮藏时间的增加而增长，本研究结果表明牛肝血布丁的挥发性盐基氮值的变化与上述研究结果相同，并且在30 d时接近25 mg/100g，说明牛肝血布丁的货架期不超过30 d.

4 结论

根据单因素试验和响应面分析得，使用风味水解酶对牛肝风味进行调控最佳条件为：初始pH 5.54、温度53.19 ℃、酶用量4.93%.此条件下，验证试验得牛肝血布丁感官评分为90.67.通过验证试验所得实际值与模型预测值接近.将此酶解后的牛肝浆添加到血布丁中，得到了状态均一，风味适宜的牛肝血布丁.根据对牛肝血布丁在4 ℃贮藏条件的品质变化，随着贮藏时间的延长，牛肝血布丁的水分含量呈现下降趋势，并且其质构发生很大变化对其风味产生很大影响，牛肝血布丁中微生物含量在30 d时超过国家规定5×104CFU/cm2，同时其挥发性盐基氮以及丙二醛在30 d时接近会发出难闻刺鼻的味道，综合评定食品的货架期为30 d.