番茄颈腐根腐病病原鉴定及其品种抗性鉴定

李潇，李雪萍，漆永红，郭成，李敏权,

(1.甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 730070)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)是茄科番茄属一年生或多年生草本蔬菜作物，原产南美洲，我国南北方广泛栽培[1-2].随着栽培年限的延长，病害的发生也逐年加重，尤其是根腐病类病害已成为阻碍番茄产业发展的主要因素之一[3-4].最早于1969年在日本发现番茄颈腐根腐病[5]，随后于1971年在美国也发现了该病害[6].如今，加拿大、墨西哥、以色列、美国、日本、韩国、南非及欧洲多数国家的番茄均受到该病害的侵染，造成严重损失[7-9].而我国发现番茄颈腐根腐病较晚，最初于2007年在北京发现[10]，之后在江苏、山东、辽宁、宁夏等地多年连作的塑料大棚和日光温室中也相继发现[11-12]，如山东省东北部烟台市、寿光市等地区均有发生，其中寿光日光温室番茄颈腐根腐病的发病率达80%以上，致死率达30%以上，造成严重减产，已成为山东省主要的番茄病害之一[13].2016年在河北省唐山市丰南区多个温室内大面积发生，发病率达30%～60%，个别棚区绝收，造成严重经济损失[14].2016年作者在调查甘肃省番茄病害时，发现了该病害，为明确其病原，本研究采集了多地番茄颈腐根腐病的样品，进行病原分离与鉴定，明确其致病性，并对来自国内外的33个番茄品种进行抗病性筛选，为该病害防控技术的研究提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器与材料 仪器：高压灭菌锅、超低温冰箱、光照培养箱、人工气候箱、分析天平、超净工作台、显微镜、高速离心机、电泳槽、PCR仪.

材料：剪刀、镊子、90 mm培养皿、封口膜、打孔器、接菌针、涂布器、离心管、移液枪、枪头、酒精灯、玻璃棒、三角瓶、烧杯、200次Fungal DNA Kit试剂盒(OMEGA)、载玻片、盖玻片、滤纸、铝箔纸；马铃薯、康乃馨叶片、葡萄糖、琼脂、琼脂糖、dNTP、TaqDNA聚合酶、loading Buffer、DNA Marker.试验所用药品均为分析纯.

1.1.2 试验培养基 PDA培养基(葡萄糖18 g、马铃薯2 000 g、琼脂15 g、水1 000 mL)；PSA培养基(蔗糖18 g、马铃薯2 000 g、琼脂15g、水1 000 mL)；PDB培养基(葡萄糖20 g、马铃薯2 000 g、水1 000 mL)；康乃馨培养基(琼脂15 g、水1 000 mL、5×5 mm康乃馨叶片).

1.1.3 供试品种 供试番茄品种：包括进口品种6个(‘精品威尼斯’‘法国红瑞娜’‘奇欧佳美’‘红玉189’‘粉果番茄’‘F199’)，台湾品种4个(‘富丽’‘千禧圣女果’‘台湾粉玉女’‘金童F1’)大陆主栽品种23个(‘精品红美女’‘粉圣果’‘中疏四号’‘黄洋梨’‘花绣球’‘元明粉玉女’‘元明红玉女’‘绿宝石’‘改良春桃’‘元明黄娇子’‘大黄金丽’‘贼不偷绿宝石’‘黄圆小番茄’‘红五彩’‘紫圣果’‘紫五彩’‘托托斯加’‘迷你紫圣果’‘魔鬼樱桃’‘美味樱桃’‘红色樱桃’‘黄色樱桃’‘粉冠一号’).供试品种由寿禾种业(欣欣然公司)提供.

1.2 试验方法

1.2.1 病害调查 2016年6月对甘肃省平凉市、天水市、武威市等地的番茄颈腐根腐病进行调查，采用五点取样法统计发病植株，计算发病率[15].

1.2.2 病原分离和纯化 将采回的样品洗净，选择典型发病植株，从病健交界处剪下根段，切成5 mm×5 mm组织块；70%酒精处理30 s后，放入0.1%的升汞溶液中消毒30 s，再用无菌水洗3次，放在已灭菌的滤纸上吸干水分，置于PDA平板上；25 ℃培养2～3 d，待菌丝长出，轻轻挑取并接种于PDA平板上进行初步纯化，然后采用单孢分离法进一步纯化[15-16]；将分离得到的镰孢菌经镜检，已产孢的直接进行单孢分离，未产孢的经康乃馨培养基诱导产孢后进行单孢分离，将单孢子置于PSA培养基上，测定生长速率，观察培养性状及形态特征.

1.2.3 病原鉴定 菌株鉴定采用形态学和分子生物学鉴定相结合的方法进行.镰孢菌形态学鉴定以Booth[17]的分类系统为基础，同时参考Lester等[18]和Leslie等[19]的分类系统.根据菌落的生长特性、颜色、菌丝的形态特征、孢子的形态、大小等进行鉴定.分子生物学鉴定采用CTAB法[20]提取菌株基因组DNA，采用真菌通用引物进行ITS序列扩增，PCR扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)与GenBank数据库中的序列进行比对，获得相近菌株r-DNA-ITS序列，利用Clustalx 1.8按照最高同源性的原则进行排序，采用MEGA 5.0软件Neighbor-joining法构建系统发育树，并采用自举法(bootstrap)对系统发育树进行检验，重复1 000次.

1.2.4 致病性测定 采用盆栽法对该病原菌的菌株进行致病性测定，选取当地主栽番茄品种‘中蔬4号’，用70%酒精表面消毒后，用45 ℃温水催芽，选取出芽一致的种子播种于营养钵中，每个营养钵10株，置于温室下生长.并用打孔器在菌落边缘取直径6 mm菌饼4片，放入装有150 mL PDB液体培养基三角瓶中，在25 ℃、125 r/min条件下振荡培养4 d，用无菌水将培养液稀释为浓度1.0×107个/mL孢子悬浮液，制成菌液.待番茄苗长到4～5片真叶时，在土壤下面 1～2 cm处用灭菌竹片刺伤0.5 cm× 0.1 cm植株表皮，将10 mL菌液浇灌至刺伤部位，每个菌株3个重复，每个重复10株幼苗，覆土，30 d后统计其发病情况，计算方法如下[16]：

发病率(%)=发病幼苗数/幼苗总数×100%

病情指数=(∑各级发病株数×病害分级代表值)/最高病级数×调查总数×100

分级标准： 0健康无病；1根基部变褐，不软腐，不缢缩，叶子健康，根无明显病斑；2根基部变褐，并有明显缢缩，叶尖或叶片发黄，根变褐； 3根基部变褐腐烂，叶片发黄，根变褐甚至变黑；4根及根基部腐烂，整株幼苗坏死.

1.2.5 菌株再分离 从致病性测定发病植株中再次分离病原，培养并观察其培养特征及显微形态，确定是否与接入菌一致.

1.2.6 品种抗性筛选 以供试的33个品种和分离得到的致病菌(F.oxysporum)为试验材料，育苗和接种方法同致病性测定方法一致，试验设3次重复.

抗病性标准参考潘卫萍、尚春明、郭威涛等[21-24]的指标，依据番茄幼苗实际发病情况调整为：免疫(I)：病情指数为0；抗病(R)：病情指数0.1～20.0；中抗(MR)：病情指数20.1～30.0；中感(MS)：病情指数30.1～40.0；感病(S)：病情指数40.1～60.0；高感 (HS)：病情指数60.1以上.

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2007软件进行统计分析和作图，并采用SPSS 19.0软件和Duncan氏新复极差法进行多重比较(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 番茄颈腐根腐病田间调查及发病症状

2.1.1 发病率 调查发现，番茄颈腐根腐病在甘肃省番茄种植区发生普遍，大棚较田间发生严重，如天水地区此病害的发生率高达40%，平凉地区为37%，武威地区发病率最低但也达22%左右(表1).

表1 不同地区番茄颈腐根腐病田间发生情况调查

同列数据肩标不同字母表示在0.05水平上差异显著.

Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05.

2.1.2 发病症状 番茄颈腐根腐病在田间的症状主要表现在茎基部有深褐色病斑，3～5叶幼苗期发病引起植株死亡，造成缺苗断垄，5叶期至开花结果期发病，则表现为茎基部病斑不断扩展，有时病斑长达5～10 cm，植株最终萎蔫死亡.该病害最初从侧根入侵，在侧根形成褐色坏死斑进而侵染主根，后期病斑扩展至地上茎基部.番茄颈腐根腐病的幼苗症状先在侧根形成圆形，褐色病变，受侵染的幼苗发黄并且侧根开始脱落，在主根上发生褐色坏死病斑，严重情况下，根皮层干燥褐变，整株死亡.成株期症状主要表现在茎基部以及根部变成黑褐色，皮层腐烂，下部叶片变黄脱落，在地面以下部分，可见褐色腐烂，纵切面可见维管束褐色、韧皮部褐色腐烂严重时番茄植株可能枯萎(图1).

2.2 病原的分离鉴定

2.2.1 形态学特征 从采到的24份样品中共分离纯化到6株菌，在PSA培养基上25 ℃培养，气生菌丝羊毛状，白色、粉色至紫色，产生粉色或紫色色素；菌株之间形态差异较大，有些菌株产生淡黄色或墨绿色微菌核；大型分生孢子镰刀形，两端渐尖，足细胞较明显，多为2～4分隔，(35～47.5)μm×(3～5)μm；小型分生孢子卵形、椭圆形或肾形，假头生，0～1分隔，(5～20)μm×(2.5～4.5)μm；厚垣孢子大量，多单生、对生、间生或顶生，球形5.5～10 μm，产孢细胞为单瓶梗，较短，单生或具分枝，(3.75～12.5)μm×(2.5～3.75)μm，参照Booth和Lester等分类系统，初步确定为尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)(图2).

A、B：番茄幼苗发病症状；C、D：成株期番茄发病症状.A、B：Symptoms of tomato seedlings;C、D:Symptoms of tomato in adult stage.图1 番茄颈腐根腐病发病症状Figure 1 Symptoms observed in the samples

A：菌株正面菌落形态；B：菌株背面菌落形态； C：大型分生孢子和小型分生孢子；D：厚垣孢子.A:Colony;B:Underside of colony；C:Macroconidia and Microcondia；D：Chlamydospore.图2 菌株的培养形态及显微形态Figure 2 Morphological characteristics of strain

2.2.2 分子生物学鉴定 将测序所得到的结果在NCBI数据库中经Blast后，发现其与尖孢镰孢菌的同源性较高，相似性均在99%以上，建树发现，此6株菌与尖孢镰孢菌的遗传距离为0，自展支持率为100，因此，此6株菌被鉴定为尖孢镰孢菌.

图3 基于18s rDNA序列构建菌株系统发育树Figure 3 Construction of strain system development tree based on 18s rDNA sequence

2.3 致病性测定

如图4所示，接种尖孢镰刀菌后番茄植株发病明显，症状典型，各菌株的发病率及病情指数如表2所示，6株菌的发病率较高，在85%左右，病情指数63左右，差异不显著，致病力强.从其发病部位再次分离菌株进行培养发现，其与接入时形态一致，符合柯赫氏法则，因此，此6株尖孢镰孢菌确定为番茄颈腐根腐病的病原.

2.4 品种抗性鉴定

由表3结果可得，在供试33个番茄品种中，完全免疫的品种未发现；筛选得到抗病品种4个，分别是‘精品红美女’‘花绣球’‘元明粉玉女’和‘红色樱桃’；中抗品种3个，分别是‘紫五彩’‘粉果番茄’和‘金童F1’；中感品种8个，分别是‘中疏四号’‘黄洋梨’‘元明红玉女’‘大黄金丽’‘黄圆小番茄’‘红玉189’‘台湾粉玉女’和‘粉冠一号’；感病品种17个，分别是‘粉圣果’‘精品威尼斯’‘元明黄娇子’‘法国红瑞娜’‘贼不偷绿宝石’‘奇欧佳美’‘富丽’‘美味樱桃’‘F199’‘黄色樱桃’‘绿宝石’‘改良春桃’‘红五彩’‘紫圣果’‘托托斯加’‘迷你紫圣果’和‘千禧圣女果’；高感品种1个，是‘魔鬼樱桃’.

3 讨论

番茄根腐类病害是一个庞大的复合体，国内很多报道将其混为一谈，或者仅仅由于丝核菌属引起的根腐或者疫霉和腐霉引起的番茄晚疫类根腐[25-27]，从而忽略了镰孢菌引起的根腐病害，另外，不同生态区域、地理、气候、土壤等因素的差异会导致病原菌的组成以及优势种的不相同.本研究首次对采自甘肃省番茄颈腐根腐病的样品进行了病原菌的分离与鉴定，结果表明，尖孢镰孢菌是引起该病害的主要病原，这与耿丽华等[10]的报道结果类似，其报道尖孢镰孢菌既能引起番茄颈腐根腐病，同时还引起番茄枯萎病的发生，颈腐根腐病与枯萎病发病条件差异很大，枯萎病一般发病在高温条件下，约30 ℃以上，而颈腐根腐病在25 ℃左右发病，二者之间的联系有待进一步研究.对分离出的6株病原菌进行致病性测定，结果表明，经病原菌处理30 d后，番茄植株发病率和病情指数分别为85%和63左右，张尚卿等[11]报道通过茎基部接种法和浸种法，接种15 d后，番茄茎腐根腐病的发病率分别为93.33%和66.67%.与本试验结果有区别，引起该结果不同的原因可能是接种方法与时间不同所引起的.本试验对33个番茄品种进行了抗性筛选试验，结果发现绝大多数品种抗性较差，从品种材料分析，国外进口和台湾的10个品种，其中7个表现为感病.这可能是由于我国传统依靠引进国外品种和台湾番茄品种增加品质和产量，但随着栽培年限的增加，病原菌已经对部分品种产生抗性，从而导致病情指数的上升，这与李景富等[28]的研究结果不同，其报道国外品种抗性大于国内品种抗性.由于不同种植地区的环境差异，需进一步进行大田区域试验，确定甘肃省抗番茄根腐颈腐病的优势品种，方可进行大面积推广和种植.近些年国内不断加大对番茄种质资源的开发和培育，新的品种已经对番茄根腐类病害产生一定抗病性，比如‘精品红玉女’‘元明粉玉女’‘花绣球’等.本次研究丰富了我国对番茄颈腐根腐病种质资源的筛选和利用，为番茄生产提供了理论指导.同时，由于目前番茄生产大多数品种表现感病，故需加强品种的替换和改良工作.

A：尖孢镰孢菌处理后；B：健康植株；A：Treated with Fusarium oxysporum;B：Healthy plants.图4 尖孢镰孢菌对番茄的致病性测定Figure 4 Pathogenicity of Fusarium oxysporum to tomatoes

表2 尖孢镰孢菌对番茄的致病性测定

同列数据肩标不同字母表示在0.05水平上差异显著.

Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05.

表3 33个番茄品种接种尖孢镰孢菌的发病率、病情指数与抗性评价

同列数据后不同字母表示在 0.05水平上差异显著(新复极差法).

Data in the same column followed by different letters are significantly different atP<0.05(New Complex Polarity Method).

4 结论

本研究经病原菌分离纯化培养、致病性测定、菌株再分离、结合菌落形态学观察和分子鉴定，确定该病害病原是尖孢镰刀菌.致病性测定发现，接种尖孢镰孢菌的植株发病明显，症状显著，不同地区采集分离的尖孢镰孢菌致病性均较强，发病率在85%左右，病情指数为63左右.通过品种抗性鉴定，筛选出‘精品红美女’‘花绣球’‘元明粉玉女’和‘红色樱桃’4个抗性品种.