两种枸杞对干旱胁迫的生理响应及抗旱性评价

李捷,崔永涛，柏延文，王立恒，杨永义，张晓玮,朱珠

(1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070；2.兰州市白塔山管理处，甘肃 兰州 730000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)为茄科枸杞属落叶灌木，分布于西北、华北、中亚、高加索和欧洲等地[3]，兼具生态效益和经济效益[4]，是盐碱和干旱地区最具开发潜力和价值的植物.近年来随着黑果枸杞市场行情的不断升温，采摘野生资源已不足以满足需求，黑果枸杞逐渐已进入了人工驯化栽培的阶段.‘宁杞1号’(L.bararumcv.‘NingqiⅠ’)是宁夏农林科学院于1987年培育的枸杞品种，为我国枸杞的主栽品种.近年来，关于枸杞对干旱生境适应机制和抗旱性评价研究较少.宋维秀等[5]通过对中国沙棘、金银花和‘宁杞1号’3 种经济灌木的抗旱试验，得出‘宁杞1 号’抗旱性强最强.种培芳等[6]采用隶属函数法对核桃、枣、枸杞、沙棘和花椒5个树种进行抗旱能力综合评价，其中枸杞隶属函数值为0.5028，抗旱能力中等.而对于黑果枸杞与现有栽培枸杞品种之间的对比研究尚未见报道.本试验以黑果枸杞和‘宁杞1号’组培幼苗为试验材料进行室内盆栽控水模拟干旱胁迫试验，研究在不同程度干旱胁迫下植株叶片生理指标的变化，评价其抗旱能力，从而对生产栽培实践与生态恢复中使用提供理论依据和参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

供试材料为黑果枸杞和‘宁杞1号’组织培养苗，外殖体采自同一健壮植株，通过单节茎段扦插技术繁殖.苗木经炼苗移栽至上口径、下口径和高分别为20、15、20 cm的塑料盆里，装入泥炭∶大田土7∶3的基质1.2 kg，每盆栽植1株.将栽植好的幼苗置于光照充足一致的避雨环境中常规管理.

待幼苗长至20 cm高时，各选取100盆幼苗，随机分为4组，进行土壤干旱胁迫试验.干旱胁迫设对照(CK)控制土壤含水量为40%±3%、轻度干旱胁迫(Light stress，LS) 控制土壤含水量为30%±3%、中度干旱胁迫(Moderate stress，MS) 控制土壤含水量为20%±3%、重度干旱胁迫(severe stress，SS) 控制土壤含水量为10%±3%，共4个处理，每处理25盆.每天8∶00用TDR水分传感器监测10 cm深处土壤水分含量，按照每盆土壤质量、基质田间持水量以及测得相对含水量计算后精确补水，使得各处理的土壤含水量保持在设定范围内，持续控水45 d后对每个处理的叶片进行混合采样，每组采集36个样品，0.5 g/个，液氮保存备用.

1.2 生理指标测定方法

O2·-(超氧化物阴离子)含量参照羟胺氧化法测定；H2O2(过氧化氢)含量参照硫酸钛沉淀法测定；MDA(丙二醛)含量参照硫代巴比妥酸法测定；可溶性糖含量按蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量按考马斯亮蓝染色法测定；Pro (游离脯氨酸)含量按磺基水杨酸法测定； POD(过氧化物酶)活性参照愈创木酚法测定；CAT (过氧化氢酶)活性参照过氧化氢法测定；SOD (超氧化物歧化酶)活性参照NBT法测定；APX(抗坏血酸过氧化物酶)活性参照Knörzer等[7]的方法测定；总酚和总黄酮含量按Liu等[8]的方法测定.

1.3 综合评价方法

1.3.1 隶属函数值法 用模糊隶属函数法对黑果枸杞和宁杞1号的抗旱能力进行综合评价.先求出各指标在各树种中的具体隶属函数值，然后对各树种隶属函数值进行累加，求其平均值，得出综合评估的指标值[9].隶属函数值法的计算公式如下：

(1)

(2)

将原始数据标准化，若抗旱指标与抗旱性正相关采用(1)式，若抗旱指标与抗旱性负相关采用(2)式，式中：Ri为供试材料的隶属函数值，Xi、Xmax和Xmin分别指试验材料对应指标的测试值、最大值和最小值.

1.3.2 抗旱性主成分分析权重系数计算方法

(3)

(4)

式中：Di为各抗旱指标对抗旱性作用的大小；Wi为各抗旱指标的代表抗旱性主成分分析权重系数；n为抗旱指标数；Fij为i抗旱指标在第j主成分上的负荷量；Yij代表i抗旱指标在第j主成分上的贡献率.

1.3.3 抗旱性综合指数计算方法

(5)

式中：I为供试材料抗旱性综合指数，I越大表示其抗旱性越强，反之则越弱.

1.4 数据处理

采用Excel 2010对试验数据进行整理和作图，不同处理间的数据使用SPSS17.0统计分析软件在0.05检验水平上做单因素方差分析，多重比较采用新复极差法.

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对黑果枸杞和‘宁杞1号’生理指标的影响

2.1.1 干旱胁迫对活性氧及膜脂过氧化程度的影响 由图1可知，当植株受到干旱胁迫时，最早响应的是以超氧阴离子和过氧化氢为代表的自由基，自由基含量上升到一定程度就会破坏植物的细胞膜，使膜透性增加从而电解质大量外渗，导致质膜氧化，MDA含量上升.2种供试材料的超氧阴离子含量、过氧化氢含量和MDA含量随着胁迫程度的加深均呈现出了不同程度的上升.其中黑果枸杞超氧阴离子、过氧化氢和MDA含量均明显低于‘宁杞1号’.在重度胁迫的条件下，‘宁杞1号’的超氧阴离子含量、过氧化氢含量和MDA含量高出黑果枸杞312.15%、149.91%、75.39%.‘宁杞1号’超氧阴离子含量、过氧化氢含量和MDA含量在CK、轻度胁迫和中度胁迫的条件下变化幅度不显著，甚至有下降的趋势；重度胁迫下3个指标出现大幅的上升，说明重度胁迫下‘宁杞1号’可能出现了“氧化爆发”，细胞膜受到了较严重破坏.而黑果枸杞3个指标上升幅度较小，说明黑果枸杞受到破坏的程度远低于‘宁杞1号’.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).CK为对照组，LS为轻度干旱胁迫，MS为中度干旱胁迫，SS为重度干旱胁迫.Different lower-case letters indicate the significant difference at 0.05 level (P<0.05).CK is the control group,LS is light drought stress,MS is moderate drought stress,and SS is severe drought stress.图1 干旱胁迫对黑果枸杞和‘宁杞1号’活性氧及膜脂过氧化程度的影响Figure 1 Effects of drought stress on ROS and membrane lipid peroxidation of L.ruthenicum and L.bararum cv.‘NingqiⅠ’

2.1.2 干旱胁迫对细胞渗透调节物质的影响 由图2可知，受到干旱胁迫以后，黑果枸杞和‘宁杞1号’的可溶性糖、可溶性蛋白以及脯氨酸含量均呈现了不同程度的上升.可溶性糖含量在受到胁迫后上升幅度显著，黑果枸杞可溶性糖含量从18.61 mg/g上升到了21.62 mg/g，上升了38.01%；‘宁杞1号’从6.85 mg/g上升到了13.52 mg/g，上升了97.37%；‘宁杞1号’可溶性糖含量上升幅度高于黑果枸杞，但黑果枸杞平均可溶性糖含量远高于‘宁杞1号’.在此过程中，黑果枸杞可溶性蛋白含量较‘宁杞1号’并未出现大幅上升，其最大值(4.62 mg/g)出现在中度胁迫时，上升幅度仅为16.64%；而‘宁杞1号’在受到干旱胁迫后可溶性蛋白含量呈现了显著的上升，从25.29 mg/g上升到了45.06 mg/g，上升幅度达到了78.18%；‘宁杞1号’平均值和上升幅度均远高于黑果枸杞.黑果枸杞和‘宁杞1号’在受到干旱胁迫后脯氨酸含量均出现了大幅的上升，黑果枸杞脯氨酸含量从0.09 mg/g上升到了0.17 mg/g，上升了87.78%；‘宁杞1号’脯氨酸含量从0.12 mg/g上升到了0.16 mg/g，上升幅度为42.76%；2个供试材料脯氨酸平均含量相当，但黑果枸杞脯氨酸含量上升幅度远大于‘宁杞1号’.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).CK为对照组，LS为轻度干旱胁迫，MS为中度干旱胁迫，SS为重度干旱胁迫.Different lower-case letters indicate the significant difference at 0.05 level (P<0.05).CK is the control group,LS is light drought stress,MS is moderate drought stress,and SS is severe drought stress.图2 干旱胁迫对黑果枸杞和‘宁杞1号’细胞渗透调节物质的影响Figure 2 Effects of drought stress on the cell osmotic adjustment substances of L.ruthenicum and L.bararum cv.‘NingqiⅠ’

2.1.3 干旱胁迫对抗氧化酶类活性的影响 POD是广泛存在于植物各个组织器官中的一种活性氧清除酶，它可以清除体内的过氧化氢和有机过氧化物以及各种有机物和无机物的氧化作用，在植物抗旱过程中有非常重要的作用.受到干旱胁迫后，黑果枸杞和‘宁杞1号’POD活性均呈现先上升后下降的趋势，两者的活性峰值均在轻度胁迫时出现，分别为58.66 μg/(g·min)和50.78μg/(g·min)，两者活性的最低值均在重度胁迫时出现，分别为17.25 μg/(g·min)和9.17 μg/(g·min)，两者上升幅度基本一致，但黑果枸杞POD活性上升得更高，下降后的活性值高于‘宁杞1号’.重度胁迫与CK相比，黑果枸杞POD活性下降了55.05%，而‘宁杞1号’则下降了269.16%，下降幅度远远超过了黑果枸杞，证明在干旱胁迫的过程当中，‘宁杞1号’受到的胁迫远大于黑果枸杞.

CAT是活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，专一催化过氧化氢还原.受到干旱胁迫后，黑果枸杞和‘宁杞1号’CAT活性的变化规律比较复杂.在胁迫的初期CAT活性呈现稳定或小幅的上升；随着胁迫程度的加深，CAT活性呈现了大幅的上升；黑果枸杞的CAT活性在重度胁迫时出现了最高值，为76.73 μg/(g·min)，而‘宁杞1号’的最大值则出现在中度胁迫时，为68.17 μg/(g·min)，在重度胁迫时‘宁杞1号’的CAT活性出现了大幅的下降.重度胁迫与CK相比，黑果枸杞CAT活性上升了67.27%，而‘宁杞1号’则下降了92.99%；此时‘宁杞1号’CAT催化还原过氧化氢的能力远弱于黑果枸杞.

SOD是膜脂过氧化防御系统的主要保护酶，能清除生物体内的自由基来维持机体内的动态平衡.受到干旱胁迫过后，黑果枸杞和‘宁杞1号’SOD活性均呈现出先上升后下降的趋势.黑果枸杞SOD活性最大值出现在中度胁迫时，为3 076.87 U/g，‘宁杞1号’的最大值出现在轻度胁迫时，为3 498.76 U/g；随着胁迫程度的加重，SOD活性出现了不同程度的下降，重度胁迫时黑果枸杞的SOD活性为2 731.56 U/g，‘宁杞1号’为2 673.23 U/g，略低于黑果枸杞；重度胁迫时与CK相比，黑果枸杞上升了23.74%，‘宁杞1号’上升了16.46%；此时黑果枸杞SOD活性较高，保证了相关自由基的持续分解.

APX是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，它不仅是叶绿体中清除过氧化氢的关键酶，还是维生素C代谢的主要酶类.在受到干旱胁迫时，黑果枸杞和‘宁杞1号’APX活性均呈现先下降后上升的趋势.在轻度胁迫时，APX活性最低，分别为1.23 μg/(g·min)和0.87 μg/(g·min)；随着胁迫程度的加深，呈现出上升的趋势，在重度胁迫时达到最大值，分别为2.66 μg/(g·min)和1.85 μg/(g·min)；与轻度胁迫时相比分别上升了115.18%和112.74%.重度胁迫时黑果枸杞APX活性显著高于‘宁杞1号’.在重度胁迫的条件下黑果枸杞和‘宁杞1号’APX活性上升，说明此时均能够保持较高还原活性氧的能力，保证了叶绿体正常工作.黑果枸杞APX活性显著高于‘宁杞1号’，说明黑果枸杞有可能更适应缺水的环境.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).CK为对照组，LS为轻度干旱胁迫，MS为中度干旱胁迫，SS为重度干旱胁迫.Different lower-case letters indicate the significant difference at 0.05 level (P<0.05).CK is the control group,LS is light drought stress,MS is moderate drought stress,and SS is severe drought stress.图3 干旱胁迫对黑果枸杞和‘宁杞1号’抗氧化酶类活性的影响Figure 3 Effects of drought stress on antioxidant enzymes activities of L.ruthenicum and L.bararum cv.‘NingqiⅠ’

2.1.4 干旱胁迫对次生代谢物质的影响 总酚和总黄酮均是枸杞属植物在代谢过程中的重要产物，总酚在枸杞的抗病过程中起着非常重要的作用，总黄酮则是枸杞属植物最重要的药用成分之一.受到干旱胁迫过后，黑果枸杞和‘宁杞1号’总黄酮含量和总酚含量变化趋势基本一致，呈现出上升的趋势.黑果枸杞的总黄酮和总酚含量的平均水平要高于‘宁杞1号’，其含量分别为415.69D325·g-1FW和584.86D280·g-1FW，分别高出‘宁杞1号’25.83%和62.33%.受到干旱胁迫后，黑枸杞的总黄酮含量上升了34.82%，‘宁杞1号’上升了60.72%；黑果枸杞的总酚含量上升了37.41%，‘宁杞1号’上升了50.42%.‘宁杞1号’受到干旱胁迫后，总黄酮总酚的平均含量低于黑果枸杞，含量上升的幅度高于黑果枸杞.可能与叶片的结构有关，黑果枸杞有更小的叶面积和更加厚的栅栏组织，这就意味着它有更强的保水能力和抗蒸腾的能力.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).CK为对照组，LS为轻度干旱胁迫，MS为中度干旱胁迫，SS为重度干旱胁迫.Different lower-case letters indicate the significant difference at 0.05 level (P<0.05).CK is the control group,LS is light drought stress,MS is moderate drought stress,and SS is severe drought stress.图4 干旱胁迫对黑果枸杞和‘宁杞1号’次生代谢物质的影响Figure 4 Effects of drought stress on secondary metabolites of L.ruthenicum and L.bararum cv.‘NingqiⅠ’

2.2 黑果枸杞与‘宁杞1号’抗旱生理指标筛选

对所测定的12项生理指标进行主成分分析，根据贡献率的大小得知各生理指标的重要性.由表1可知，这3个主成分的综合指标累积贡献率达到88.63%，能够充分反映黑果枸杞和‘宁杞1号’的抗旱性情况.其中第1主成分的特征值为5.29，贡献率为44.21%，包含了超氧阴离子、过氧化氢、可溶性糖、可溶性蛋白、CAT、总黄酮和总酚7项生理指标，说明了第1主成分主要反映的是干旱胁迫对活性氧的激发、细胞渗透调节物质以及对次生代谢物质的影响；第2主成分的特征值为3.45，贡献率为28.71%，包括MDA、Pro、POD和APX 4项生理指标，说明了第2主成分主要反映的是干旱胁迫对细胞膜氧化程度、渗透调节物质和细胞保护酶活性的影响；第3主成分的特征值为1.90，贡献率为15.80%，仅有SOD 1项生理指标.通过对各项抗旱性生理指标的主成分分析表明：可溶性糖、SOD、总酚、超氧阴离子和过氧化氢 5个指标的载荷量大，可作为黑果枸杞和‘宁杞1号’抗旱性强弱鉴定的指标.

表1 黑果枸杞和‘宁杞1号’各抗旱性生理指标主成分分析

2.3 黑果枸杞与‘宁杞1号’抗旱性综合评价

如表2所示，通过对黑果枸杞与‘宁杞1号’的超氧阴离子、过氧化氢、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、POD、CAT、SOD、APX、总酚、总黄酮等12项抗旱相关生理指标的抗旱性隶属函数值进行计算，并根据主成分分析结果对各指标进行合成，获得黑果枸杞与‘宁杞1号’的抗旱性综合指数.黑果枸杞的综合指数为0.466，‘宁杞1号’的综合指数为0.446，说明黑果枸杞抗旱性稍强于‘宁杞1号’.

若参考李禄军等[10]的研究结果，根据供试材料其抗旱性综合指数值I划分，1≥I≥0.6，高度抗旱；0.6≥I≥0.4，中度抗旱；0.4≥I≥0.2，弱抗；I≤0.2，不抗旱；黑果枸杞与‘宁杞1号’均属于中度抗旱树种.

3 讨论

在非逆境条件下，植物体内的清除机制可以使活性氧的产生与清除保持动态平衡，使活性氧的含量保持在正常水平.在受到逆境胁迫时，植物体活性氧的产生加快，清除功能降低，致使活性氧在体内积累，植物的结构和功能受到损伤[11].丙二醛(MDA)是膜脂在活性氧的作用下诱发的过氧化反应产物[12]，能直接毒害植物细胞.姚允聪等[13]和马文涛等[14]对Malusrobusta和4种柑橘(Citrusreticulata)的干旱胁迫试验证明，O2·-和过氧化氢产量随着水分胁迫的加剧而出现上升.李永洁等[15]将黑果枸杞经过一段时间的干旱胁迫处理，随着胁迫程度的加剧，其体内的MDA含量呈上升趋势.通过黑果枸杞和‘宁杞1号’的试验结果表明，超氧阴离子含量、过氧化氢含量和MDA含量呈现出先下降后上升的趋势，轻度胁迫时最低，随着胁迫的加深含量不断的上升，与上述研究者的研究结果基本类似.‘宁杞1号’3个指标的平均含量均高于黑果枸杞，在相同的胁迫程度下‘宁杞1号’受害程度可能高于黑果枸杞.

表2 黑果枸杞和‘宁杞1号’各抗旱性生理指标隶属函数值

O2·-为超氧阴离子；MDA为丙二醛；SS为可溶性糖；SP可溶性蛋白；Pro为脯氨酸；APX为抗坏血酸过氧化物酶.

O2·-is superoxide anion；MDA is malondialdehyde；APX is Ascorbic acid peroxidase.

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物应对水分胁迫时最为重要的渗透调节物质，它们的含量上升使细胞具有较高的渗透势，细胞水势下降，同时可使细胞壁和保护酶系统保持稳定，提高细胞的抗逆性，也减小缺水带来的伤害[16].张翠梅等[17]通过PEG-6000胁迫抗旱能力不同的3种苜蓿(Medicagosativa)，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸均呈现上升的趋势，与本文研究结果类似.种培芳等[6]对核桃(Juglansregia)、枣(Ziziphusjujuba)、枸杞、沙棘(Hippophaerhamnoides)和花椒(Zanthoxylumbungeanum)等5种经济林树种的进行干旱胁迫后发现可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸3个指标均出现了先降低后上升的现象[6]，与本试验中趋势不同，究其原因可能是所用的土壤有较高的孔隙度，能够在低含水量在一定程度时保证植株水分的供应.在本研究中，黑果枸杞可溶性糖含量和脯氨酸含量积累速度显著高于‘宁杞1号’；而‘宁杞1号’可溶性蛋白含量随干旱程度加剧而呈现出上升的趋势.可能在黑果枸杞抗旱过程中脯氨酸和可溶性糖起到更加重要的作用，而可溶性蛋白在‘宁杞1号’的抗旱过程中起到更加重要的作用.

POD、CAT、SOD和APX是植物体内广泛存在的活性氧清除酶，可以清除体内的过氧化氢和有机过氧化物以及各种有机物和无机物的氧化作用，在植物抗旱性中有非常重要的作用，降低自由基对植物膜系统的伤害[18].韩忠明等[19]对防风(Saposhnikoviadivaricata)叶片和李明等[20]对甘草(Glycyrrhizauralensis)幼苗的研究结果显示，随干旱胁迫程度的加重，SOD活性先升高后降低.朱琳等[21]对夏腊梅(Sinocalycanthuschinensis)的研究显示，随干旱胁迫程度的加剧POD 活性不断上升.但李楠等[22]、张仁和等[23]学者发现在干旱胁迫加剧的情况下POD活性表现出先上升而后下降的现象.单长卷等[24]对冰草(Agropyroncristatum)的研究表明随干旱胁迫程度的加剧CAT活性呈先上升后下降的趋势.季杨[25]对鸭茅(Dactylisglomerata)研究认为在干旱胁迫下APX活性呈先上升后下降的趋势.本试验中随着干旱胁迫的加剧， POD活性、CAT活性和SOD活性呈现升高后降低的趋势，在中度胁迫时活性显著升高，重度胁迫时显著下降，与多数研究结果类似.这说明2种材料对土壤水分变化较为敏感，耐受上限在中度胁迫与重度胁迫之间.而APX活性呈现出先下降后上升的趋势，与季杨[25]的研究结果相反，其可能的原因是枸杞属植物的抗旱性能力高于鸭茅所致.黑果枸杞与‘宁杞1号’4个指标有所差异，特别是在重度干旱胁迫时‘宁杞1号’4个酶活性显著低于黑果枸杞，说明‘宁杞1号’抗旱能力可能弱于黑果枸杞.

总酚和总黄酮均是枸杞属植物在代谢过程中的重要产物，总酚可以帮助植物对病原菌、天敌、紫外线和干旱等的伤害进行抵抗[26]；总黄酮通过抗氧化作用能够在一定程度上减轻水分胁迫引起的膜脂抗氧化作用对植物造成的伤害[27].当烟草(Nicotianatabacum)处于干旱胁迫时，总酚含量增加[28].马铃薯受干旱胁迫对黄酮合成基因表达有促进作用，黄酮含量上升[29].在本研究中黑果枸杞总酚和总黄酮含量显著高于‘宁杞1号’，说明这2个指标在黑果枸杞抗旱过程中起到更加重要的作用.

在黑果枸杞与‘宁杞1号’的抗旱性综合评价中，参考李禄军等[10]的研究体系，根据供试材料其抗旱性综合指数值I划分，将黑果枸杞(0.466)与‘宁杞1号’(0.446)划分为中度抗旱树种.该结果与种培芳等[17]对‘宁杞1号’的抗旱评价结果类似，与何芳兰等[30]对黑果枸杞的抗旱评价结果亦类似，但黑果枸杞和宁夏枸杞(L.bararum)在野生生境时要求具备较强的抗旱性，人工栽培后抗旱能力有所下降，原因有待进一步研究.本研究中可溶性糖、SOD、总酚、超氧阴离子和过氧化氢5个指标主成分分析时载荷较大，故选取为鉴定黑果枸杞和‘宁杞1号’抗旱能力的关键指标.

4 结论

1) 通过对黑果枸杞与‘宁杞1号’的12项抗旱相关生理指标的抗旱性隶属函数值进行计算，并根据主成分分析结果对各指标进行合成的抗旱性综合指数显示：黑果枸杞(0.466)抗旱性强于‘宁杞1号’(0.446).此综合指数区间树种为中度抗旱树种.

2) 通过对各项抗旱性生理指标的主成分分析表明，可溶性糖、SOD、总酚、超氧阴离子和过氧化氢 5个指标的载荷量大，可作为黑果枸杞和‘宁杞1号’抗旱性强弱鉴定的指标.