小麦ILs群体SSR分子标记遗传连锁图谱构建

吕百川，苏其红，辛筱筱，孙娟，刘小雪，刘媛，杨德龙

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

遗传连锁图谱构建是作物复杂数量性状位点(quansitative trait locus，QTL)定位、基因图位克隆和分子标记辅助选择育种等研究和应用的重要依据，而分子标记技术为遗传遗传图谱构建提供了有力的工具[1-2].目前，作物遗传连锁作图构建中常用的分子标记有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)等，其中SSR标记因其数量丰富、覆盖度高、共显性遗传、多态性信息量高、操作简单、稳定性好等优点而被广泛应用于玉米、水稻、小麦、棉花和大豆等作物构建遗传连锁图谱[3-5].1998年，Röder等[6]构建了第1张小麦微卫星遗传图谱，并将定位的SSR位点命名为GWM.Hayden等[7]在1个‘中国春’בSQ1’小麦作图群体上将53个SSR标记位点定位并命名为Xpsp.自此SSR标记成为构建小麦遗传连锁图谱的有效工具.Pestsova等[8]将55个从粗山羊草分离的D基因组专化性微卫星标记(GDM)整合到ITIM的‘Opata85’בW79840’作图群体遗传框架图上.此外，国际小麦微卫星协会(wheat microsatellite constructium，WMC)也将开发的一些WMC标记整合到已有的小麦遗传框架图上[9].随即，Nachit等[10]将26个SSR位点定位于硬粒小麦的1个种内重组自交作图群体分子连锁图谱上，Pillard等[11]将179个SSR位点定位到由两个瑞士冬性小麦品种Arina、Forno杂交所产生的RIL群体遗传连锁图上.

如今，小麦分子标记和遗传连锁图谱的数据库，如： GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、EMBL(http://www.embl- heidelberg.de)、DDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp)、Gramene(http://www.gramene.org)和GrainGenes(http://www.graingenes.org)等相继开放，为小麦高密度遗传连锁图谱构建奠定坚实的信息平台.然而，由于小麦基因组庞大(1.6×1010bp)，结构复杂，利用不同遗传背景材料构建遗传连锁图谱有利于发掘小麦更多的遗传信息和一致性高密度遗传连锁图谱构建.小麦ILs群体通过多次回交保留了高比率的轮回亲本基因型，同时渗入供体亲本染色体片段(基因)，有效排除了遗传背景对导入基因的干扰，是复杂数量性状QTL精细定位与图位克隆的理想遗传材料[12-14].因此，本研究利用1套有抗旱遗传背景的ILs群体为材料，通过SSR标记基因分型和遗传连锁图谱构建，将为小麦复杂数量性状QTL精细定位和分子标记辅助选择育种奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以1套以‘西峰20’为供体亲本和‘晋麦47’为轮回亲本，经杂交、回交和自交建立的由160个株系组成的ILs群体(BC3F4)为试验材料.供体亲本‘西峰20号’是由庆阳地区农科院用‘西峰18号’作为母本，与‘CA8055’杂交，通过单株选择和稳定世代的株系比较、鉴定育成，有抗寒、抗旱、抗病的特点.轮回亲本‘晋麦47号’由山西省农科院旱地小麦育种组以‘12057’作为母本，以‘522’בK37-20’为父本，杂交选育而成，耐旱耐冻，分蘖力强.两亲本在抗旱性、持绿性、株高和产量性状等方面有显著差异，群体表型变异广泛[15-17].

1.2 基因组DNA的提取与检测

采用水培法将小麦幼苗长至两叶一心，剪取幼嫩叶片4～5 g，液氮冷冻研磨，磨成粉末状置于-80 ℃冰箱低温保存.采用CTAB法[18]提取基因组DNA.用紫外分光光度计法检测其质量和浓度，稀释至20～50 ng/μL，-20 ℃保存备用.

1.3 引物合成

参照Somers等[19]构建的小麦SSR标记整合图谱，选取2 306对均匀分布在21条染色体上的SSR引物(Xmag，Xcnl，Xksum，Xbarc，Xcfa，Xcfd，Xgdm，Xgwm，Xwmc和Xcewm)，进行SSR标记分型.引物序列信息从Graingene(http://wheat.pw.usda.gov/)网站中获取，由上海生工合成.

1.4 SSR标记分型检测

PCR采用10 μL反应体系，扩增程序参照Korff等[20]设定的降落PCR(Touch-down PCR)程序，稍作改动，64～55 ℃梯度降温退火延伸30个循环.扩增产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，参考Sanguinetti等[21]的报导进行染色显影.将有带记为“1”，无带或模糊记为“0”，缺失记为“-1”，统计条带矩阵.

1.5 SSR多样性分析

利用Powermarker V3.25软件对多态性SSR位点进行统计分析，计算等位位点频率、等位位点数目、遗传多样性指数、重组率以及多态性信息量(polymorphism information content，PIC)、遗传距离(genetic distance，GD)等参数值，并进行聚类分析.

1.6 SSR标记偏分离分析及遗传连锁图谱的构建

对统计的多态性SSR标记分型结果进行χ2检测和偏分离分析.利用Joinmap 4.0软件构建遗传连锁图谱(LOD≥2.5).利用Mapchart V 2.2软件绘制连锁图谱.

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

利用小麦2 306对均匀分布在小麦21条染色体的SSR引物对ILs群160个株系及其亲本进行基因型分型(图1)，共检测出442个多态性SSR标记，多态性频率为19.17%.通过遗传多样性分析发现，平均每个SSR位点等位变异的频率为0.75，遗传多样性指数(H′)为0.31，多态性信息量(PIC)为0.25，同时核苷酸杂合度明显低于基因多样性指数(表1).不同染色体间的H′在0.19(5D)～0.42(3B)，杂合度在0.09(5D)～0.24(2B)，PIC在0.16(6A)～0.33(2B)之间.在不同基因组间， B基因组的H′与PIC较高，分别为0.32和0.26，而D基因组的较低，分别为0.28和0.23.不同同源群间，第Ⅲ同源群的H′与PIC较高，分别为0.36和0.28，而第Ⅰ同源群的较低，分别为0.27和0.22(图2).

M:marker；P1：‘晋麦47’ Jinmai 47；P2：‘西峰20’ Xifeng 20. 图1 Xksm148标记在小麦ILs群体中的检测结果Figure 1 Genotyping by Xksm148 in wheat ILs population

表1 小麦ILs群体不同染色体间的遗传多样性

图2 小麦ILs群体不同基因组及同源群间的遗传多样性Figure 2 Genetic diversity between different genomes and homologous groups in wheat ILs population

2.2 聚类分析

小麦ILs群体160个株系的遗传距离变幅为0.03～0.10之间，以100与101遗传距离较小为0.03，表明这2个株系之间遗传差异较小，亲缘关系最近；89与107之间的遗传距离最大为0.10，二者间亲缘关系相对较远.该群体160个株系间的平均遗传距离为0.06，说明了各株系间的遗传差异较小，表现出ILs群体的遗传特点.根据遗传距离，该群体可被分为5大类群(图3)，其中第Ⅰ类包括10个株系；第Ⅱ类包括29个株系；第Ⅲ类包括39个株系；第Ⅳ类包括34个株系；第Ⅳ类包括48个株系.

图3 小麦ILs群体聚类图Figure 3 Neighbor-joining tree for the wheat ILs population

2.3 SSR标记偏分离分析

对得到的442个多态性SSR标记进行χ2检测(卡方检测)，在P<0.01的情况下，共检出103个偏分离标记，偏移频率为23.30%.其中，有61个SSR标记偏向于轮回亲本‘晋麦47’，占偏分离标记点数59%，其余42个标记更偏向于供体亲本‘西峰20’，占偏分离标记点数41%.除5A染色体上未检测到偏分离位点外，其余各染色体上均检测到偏分离标记，其中大部分标记表现为分散状态，少部分表现为富集现象主要分布在1B、3B和4A染色体上.在不同的基因组间，B基因组偏离标记最多为50个，A基因组次之为27个，D基因组偏离标记最少为26个(图4).

图4 偏分离SSR标记在不同染色体上的分布Figure 4 Distribution of SSR markers with segregation distortion on different chromosomes

2.4 遗传连锁图谱的构建

利用442个多态性SSR标记构建了小麦ILs群体遗传连锁图谱(图5).该图谱总长度为5 857.39 cM，每条染色体的平均长度为277.27 cM，标记间的平均距离为13.25 cM.由图5可知，每条染色体和同源群上标记数目和遗传距离显著.其中，1B染色体分布的标记数目较多(53个SSR)，6D染色体分布的标记较少(7个SSR)；1B遗传距离较长(557.16 cM)，1D染色体较短(95.88 cM)；标记间平均距离6A染色体较大(20.89 cM)，1D染色体较小(5.99 cM).在各同源群中，第Ⅰ同源群定位的SSR标记数目较多(83个SSR)，第Ⅵ同源群较少(35个SSR)；第Ⅴ同源群遗传距离较长(989.92 cM)，第Ⅵ同源群较短(494.4 cM)；第Ⅰ同源群标记的平均距离较短(9.38 cM)，第Ⅵ同源群较长(16.18 cM).在各基因组中，B基因组定位的SSR标记数目较多(221个SSR)，D基因组定位的较少(91个SSR)；B基因组遗传距离较长(2 782.32 cM)，D基因组较短(1 114.57 cM)；B基因组标记的平均距离较长(12.96 cM)，D基因组标记较短(12.54 cM).

3 讨论

3.1 小麦ILs群体基于SSR标记的遗传多样性

研究表明，衡量SSR标记遗传多样性的指标主要是遗传多样性指数、多态信息量及核苷酸杂合度，其中遗传多样性指数与多态信息量越大说明使用价值越大[22].在本研究中，小麦ILs群体遗传多样性与多态信息量相对较低，聚类遗传距离变幅较小，其中核苷酸杂合度明显低于遗传多样性且很多位点接近于0，说明这些位点在选择中接近纯合，表现出各株系间亲缘关系较近，凸显了小麦ILs群体经多次回交和自交，株系间的遗传差异均由导入的供体亲本染色体片段差异造成的特点.

图5 小麦ILs群体的遗传图谱Figure 5 Genetic map for the wheat ILs population

本研究中，通过对小麦各基因组、同源群以及各染色体进行遗传分析发现， B基因组遗传多样性较高，而D基因组的较低，这与前人得出B基因组承载大量的具产量和品质的基因，在人工选择过程中，给予较多的选择压，遗传变异较大的结果相吻合[23-25].此外，在不同的同源群间，第Ⅲ同源群遗传多样性较高，第Ⅰ同源群较低；在不同的染色体间，2B、3B的遗传多样性较高，1B、1D、5D和6B的较低.说明，在小麦ILs群体中，3B染色体可能赋予了更多的遗传变异积累，而1D等染色体组遗传变异相对保守.

3.2 小麦ILs群体遗传连锁图谱特征

在一个分离群体中，观察得到的基因型比例偏离预期的孟德尔分离规律的现象叫做偏分离，基本所有类型杂交分离群体都存在偏分离现象，是生物进化的主要动力之一[26].在本研究中，对得到的442个SSR标记进行χ2检测，在P<0.01的情况下，共检出103个偏分离标记，偏移频率23.30%，其中偏向于轮回亲本晋麦47的偏分离标记点数占59%.这说明在小麦ILs的后代选择中，更多的保留了轮回亲本晋麦47的遗传背景，可能是因为雄配子体的选择[27]或群体类型和杂交组合的亲缘关系远近[28]引起的.因此，在构建遗传连锁图谱时尽量选择低偏离概率的分子标记.

本研究所建遗传连锁图谱总长度为5 857.39 cM，高于前人所建的遗传连锁图谱[28-31].每条染色体的平均长度为277.27 cM，标记间的平均距离为13.25 cM，满足遗传图谱分子标记QTL定位的标准(10～20 cM).其中，多态性标记主要分布于A和B基因组上，D基因组上分布的较少，仅占21%.对比前人研究结果，本研究建立的遗传连锁图谱与Wheat composite 2004 (http//wheat.pw.usda.gov/ggpages/mapse shortlist.html.)高密度遗传图谱具有很好地共线性；并且D基因组较为保守，定位在遗传连锁图谱上的多态性标记明显低于A、B基因组[29-31].不同于前人D基因组标记间的稀疏，本研究小麦D基因组标记间的平均距离较小，标记密度较大，是对小麦遗传图谱信息的有力补充.因此，利用有效排除遗传背景对导入基因干扰的小麦ILs群体构建遗传连锁图谱，将为小麦复杂数量性状QTL精细定位奠定理论基础.