适配子PBCA-USPIO纳米微粒的制备研究

陈文学 邹学森 胡文强 王春阳 黄秀珍 周雪春 程为良

鼻咽癌复发和转移是其主要的死亡原因[1-2]，目前鼻咽癌复发转移诊断主要依靠颈部淋巴结影像学检查。影像学检查对淋巴结转移的诊断主要依赖淋巴结形态改变及与周围组织器官的关系。很小的淋巴结内部也有可能发生早期的微小转移灶，因此单纯依靠形态学诊断无法满足临床诊断的需求[3]。分子成像是将分子生物学方法与现代医学影像技术相结合，无创性探查体内生理和病理状态下分子和细胞水平的生物过程。MRI空间分辨率高，软组织对比度好，不受成像组织部位限制，尤其适用于实体瘤和淋巴结的检出，但由于常规造影成像对淋巴结内微小转移灶诊断特异性和敏感性较低，无法满足临床诊断隐蔽性淋巴结转移的需求。因此本文对传统造影剂进行改良工艺研究，用聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)包裹造影剂超小顺磁氧化铁(USPIO)形成具有良好降解性和生物相容性的PBCA-USPIO改良造影剂[4]，改造后的造影剂连接具有靶向功能的鼻咽癌特异性适配子探针(AP-PBCA-USPIO)，使造影剂具有靶向性。

1 材料与方法

1.1 试剂

α-氰基丙烯酸正丁酯(α-BCA)购自浙江金鹏化工股份有限公司；右旋糖酐-70购自SIGAMA公司；无水乙醇(分析纯)、盐酸(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)购自郑州市化学试剂厂，链霉亲和素购自赛默飞科技有限公司，生物素标记适配子购自上海生工。

1.2 仪器

85-2恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)，JSM-7001F透射电镜(日本电子公司)，紫外分光光度计(Eppendorf有限公司)，电子分析天平(日本津岛)。

1.3 方法

1.3.1 共沉淀法合成USPIO 将FeCl35.74 g和FeSO4·7H2O 2.78 g充分溶解于20 ml蒸馏水中，将液体转入三角烧瓶中置于恒温磁力搅拌器上，温度保持60 ℃，搅拌时间10 min，将液体倒入烧杯中置于高磁场下冷却，可见分层，将上清液倒掉，加入氨水(pH 8.0)反复洗3遍，加入上述氨水40 ml。月桂酸1 g充分溶解于20 ml水中。

1.3.2 PBCA-USPIO的制备工艺 采用乳化聚合法[5]制备PBCA-USPIO。BCA单体用二氯甲烷稀释(VCH2CL2∶VBCA=5∶1)，配制KH2PO4-K2HPO4酸性缓冲液20 ml，在溶液中加入表面活性剂缓冲溶液，在溶液中加入表面活性剂右旋糖酐-70，将浓度为20 mg/ml的USPIO滴入混合液中，1 200 rpm搅拌5 min，搅拌同时缓慢滴入稀释后的BCA单体，持续乳化聚合一定时间后，用NaOH溶液终止反应，减压抽滤，即得稳定的PBCA-USPIO纳米混悬液。

1.4 正交设计优化制备条件

在一定范围内，反应溶液的pH值、BCA单体浓度、右旋糖酐-70稳定剂浓度是影响纳米粒粒径大小及均勾度的主要因素。应用正交表L9(33)进行正交实验分析，依次设置三个正交因子A(pH值)、B (BCA单体浓度)、C(右旋糖酐-70浓度)，3个水平优化PBCA-USPIO的制备条件，见表1。

表1 各因素水平

注：A为pH值；B为BCA单位浓度；C为右旋糖酐-70浓度。

1.5 制备适配子PBCA-USPIO纳米粒子

用NaOH溶液将PBCA-USPIO纳米粒子混悬液调整到pH 9.0并作用1 h，使PBCA表面产生羧基基团，然后将溶液调整到pH 7.0。加入用PBS溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和链霉亲和素，PBCA-USPIO：链霉亲和素：EDC摩尔比为1∶10∶25，4 ℃反应12 h，加入生物素化的适配子，孵育10 min，即可得到适配子PBCA-USPIO纳米微粒混悬液。适配子PBCA-USPIO纳米粒子用透射电镜进行鉴定。

1.6 适配子PBCA-USPIO纳米粒子的T2驰豫率测定

将适配子PBCA-USPIO纳米粒子溶液用水稀释到铁浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/l，MR扫描连续测定4个层面T2值，取平均值。T2驰豫率=铁浓度与1/T2直线方程的斜率。

1.7 适配子PBCA-USPIO细胞毒性测定

取对数生长期的Hela细胞，按照每孔5000个细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100 μl，37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h弃上清，分别加入100 μl用10%胎牛血清的培养基配制成含铁50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml、1 000 μg/ml适配子PBCA-USPIO和USPIO，每个浓度设4个复孔。空白组加入100 μl的培养基，样品对照组加入100 μl纳米粒子，正常对照组加入100 μl细胞悬液。37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，继续培养4 h，每孔加入150 μl二甲基亚砜，在平板振荡器上振荡10 min，在酶标仪490 nm波长测定吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率[6]=(样品孔OD值-样品对照孔OD值)/正常对照孔的OD值。

1.8 统计学方法

应用SPSS 20.0进行统计学分析，PH值、BCA单体浓度、右旋糖酐-70浓度采用正交设计方差分析。细胞毒性测定用析因设计方差分析。

2 结果

2.1 正交设计及结果

按L9(33)设计成3因素3水平的正交实验，实验结果见表2。最优方案为A2B2C3，即pH6.0，BCA单体浓度3%，右旋糖酐-70浓度15%。

表2 正交设计实验结果(n=3)

注：A为pH值；B为BCA单位浓度；C为右旋糖酐-70浓度。

2.2 适配子PBCA-USPIO形态鉴定

最优处方制备适配子PBCA-USPIO激光粒度分析仪测定结果显示粒子直径成正态分布。透射电镜观察显示其形态为类球形,包壳光整，见明显的壳核结构，平均粒子直径为(83±7)nm。

2.3 适配子PBCA-USPIO纳米微粒的T2驰豫率

驰豫率是反应造影剂在磁共振时对驰豫过程的影响程度。超顺磁造影剂驰豫率越大负性强化效果越明显。从图1可以看出随着铁浓度的增加，T2值逐渐下降，T2的驰豫率为铁浓度与1/T2直线方程的斜率，因此适配子PBCA-USPIO纳米微粒的铁浓度(mmol/l)与1/T2(1/ms)直线方程为y=0.160x+0.005, T2驰豫率为0.16×106mol-1s-1。

图1 铁与T2的回归曲线

2.4 适配子PBCA-USPIO纳米微粒的细胞毒性实验

MTT法测定细胞在适配子PBCA-USPIO和USPIO作用下的活性见图2。随着铁浓度的增加，Hela细胞存活率逐渐下降，两组纳米颗粒对Hela细胞的毒性有显著差异，USPIO组细胞毒性明显强于适配子PBCA-USPIO组(F=3590.08,P<0.05)。通过多重比较分析，两种纳米颗粒随着浓度的增加毒性增强(P<0.05)。不同浓度的两种纳米颗粒细胞毒性有显著性差异(F=1318.77,P<0.05)。

图2 不同铁浓度Hela细胞的存活率

3 讨论

淋巴结是否累及是肿瘤分期、治疗方案、判断预后的重要指标。判断淋巴结是否转移通常依据CT或MRI的淋巴结直径，在确定淋巴结转移直径界值一直有争议，有些转移的淋巴结和正常淋巴结大小相似。USPIO是比较理想的MRI对比剂，它的MRI增强扫描可以发现淋巴结内的转移灶，与淋巴结是否增大无关。

PBCA的聚合方法主要有界面聚合法和乳化聚合法，界面聚合法是在搅拌的条件下将油相(含有药物、有机溶剂等)加入到水相(含有表面活性剂)当中，在油水界面进行阴离子聚合反应形成纳米粒，蒸发掉有机溶剂后可得到载药的纳米粒，乳化聚合法是向含有表面活性剂的水相中加入单体，单体和水溶液形成乳液，溶液中的OH-引发乳液颗粒的聚合进而形成纳米微粒，药物被包裹于纳米微粒中。因乳化法操作简单，适用于水溶性药物的载体制备，因此本研究采用乳化聚合法，制备的纳米微球小于100 nm,与其他研究中制备的微球粒径相似[7-8]。

Fe是USPIO的主要成分，如果铁含量增加可以对人体产生毒性作用。因此本研究用HeLa细胞进行细胞毒性实验，研究不同铁浓度的适配子PBCA-USPIO和USPIO与HeLa细胞孵育后的细胞存活率。结果显示两组随着铁浓度增加，细胞毒性也增加，且呈正相关关系，在≥100 μg/ml时同等铁浓度的情况下，适配子PBCA-USPIO的细胞毒性明显低于USPIO，铁浓度在1 000 μg/ml时PBCA-USPIO组HeLa细胞的存活率达到69.5%远高于USPIO组15.5%。研究显示用鼠肝细胞与SPIO共孵育24 h，当铁浓度达到250 μg/ml时，细胞死亡率达到50%，这与本研究数据接近[9]。USPIO的细胞毒性大是因为USPIO疏水性大，与细胞膜相互作用强[10]，可以被细胞吞噬，释放游离铁导致细胞内蛋白质氧化和DNA损伤，最终使细胞死亡[11]。当PBCA包裹USPIO后，颗粒与细胞的疏水作用减弱，细胞对颗粒的吞噬减少，细胞内铁含量也减少，所以细胞毒性下降。