右旋糖酐酶酶学性质研究

问清江，慕 娟，孙晓宇，丁 浩

(陕西省微生物研究所， 陕西 西安 710043)

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)属于糖苷水解酶，专一性裂解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷键，使右旋糖酐分子降解为小分子的右旋糖酐、异麦芽糖、异麦芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶可用于医药工业和食品工业，防治龋齿，酶解高分子右旋糖酐制造血浆代用品，在甘蔗制糖业中处理微生物发酵产生的大分子右旋糖酐而降低黏度增蔗糖产率[1～3]。右旋糖酐(Dextran)是主要由葡萄糖α-1,6糖苷键连接而成的葡聚糖。是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，也是美国FDA批准的第一种可用于食品和药品的微生物胞外多糖。由肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)产生的右旋糖酐蔗糖酶合成的右旋糖酐含有95%的α-(1,6)糖苷键，同时含有少量其它糖苷键的分支结构[4]。右旋糖酐具有安全、无毒等多种优点，被广泛应用于医药、食品等多个领域。临床上应用的常有3种规格产品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20，是目前公认的优良血浆代用品之一。具有增加血容量、改善微循环、防止弥散性血管内凝血的作用，主要用于治疗失血性休克[5]。药用右旋糖酐传统生产工艺是盐酸水解高分子右旋糖酐得到不同分子量的右旋糖酐，水解效率低，而且引入氯离子产生大量的氯化物严重影响了右旋糖酐产品质量，容易产生不良反应。采用右旋糖酐酶水解右旋糖酐，专一性提高水解效率，水解条件温和，减少氯化物对产品品质的不良影响。对右旋糖酐酶进行酶学性质研究，为右旋糖酐的酶水解前期探究和技术储备。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 右旋糖酐酶(宁夏夏盛实业集团有限公司)。

1.1.2 右旋糖酐(自制)。

1.1.3 试剂 葡萄糖, Sigma公司产品；3, -二硝基水杨酸(DNS),化学纯；其他试剂为市售分析纯。

1.1.4 仪器 752分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；HH-4A电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐酶的最适反应温度 适当稀释酶液，分别在40、45、50、55、60、65℃反应温度下测定右旋糖酐酶活力，绘制最适温度曲线确定最适反应温度。

1.2.2 右旋糖酐酶的最适反应pH 分别用pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0缓冲液适当稀释酶液，并在相对应不同pH值条件下进行酶促反应，测定右旋糖酐酶活力，绘制最适pH曲线确定最适反应pH。

1.2.3 右旋糖酐酶的最适反应底物浓度 分别在右旋糖酐浓度0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%条件下进行酶促反应，测定右旋糖酐酶活力，绘制底物浓度曲线确定最适反应底物低浓度。

1.2.4 右旋糖酐酶的热稳定性 酶液分别在45、50、55、60、65℃下放置1 h，每隔10 min取样测定其残余活力，绘制右旋糖酐酶热稳定性曲线。

1.2.5 右旋糖酐酶的酸碱稳定性 分别用pH2.2、3.0、5.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.6 、10.0的缓冲液适当稀释酶液，4℃放置24 h，测定其残余酶活，绘制右旋糖酐酶酸碱稳定性曲线。

1.2.6 金属离子对右旋糖酐酶活力的影响 在适当稀释的酶液中分别加入Mn2+、 Ba2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Fe3+、Mg2+，使酶促反应体系中金属离子浓度为5 mmol·L-1，测定右旋糖酐酶活力。

1.2.7 右旋糖酐酶底物特异性 分别以重均分子量T-10、T-40、T-70、T-500、T-1000、T-10000的右旋糖酐为底物进行酶促反应，测定右旋糖酐酶活力。

1.2.8 右旋糖酐酶活力的测定 采用DNS法测定右旋糖酐酶活力。配制1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液，分别量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖标准溶液，用蒸馏水补齐1 mL，再加入2mLDNS，沸水浴2 min，流水冷却后加蒸馏水至10 mL，在540 nm测定光吸收值，绘制葡萄糖糖标准曲线，得出回归方程用于葡萄糖和右旋糖酐酶活力测定。将酶液用一定pH值的缓冲液适当稀释后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL1%的右旋糖酐溶液中，50℃准确反应10 min，加入2 mLDNS终止反应，沸水浴2 min显色，然后流水冷却至室温，定容至10 mL；空白对照，0.5 mL1%的右旋糖酐溶液50℃准确反应10 min，先后加入2 mLDNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min显色，然后流水冷却至室温，定容至10 mL。以蒸馏水为对照测定540 nm的吸光值，样品和空白对照的吸光值之差根据回归方程得出反应液中的葡萄糖量，从而确定酶活。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟催化右旋糖酐产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

2 结果与分析

2.1 右旋糖酐酶的最适反应温度

图1温度对右旋糖酐酶反应的影响

在40、45、50、55、60、65℃不同温度条件下进行酶促反应,检测右旋糖酐酶活力，结果见图1。从图1可以看出，随着温度的升高，由于反应速率的提高，右旋糖酐酶活力呈现增加趋势，55℃时酶活力最高；随后右旋糖酐酶活力出现降低趋势，与酶的热稳定性有关。该右旋糖酐酶的最适反应温度为55℃。

2.2 右旋糖酐酶的最适反应pH

在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0不同pH条件下进行酶促反应，检测右旋糖酐酶活力，结果见图5。随着pH值的升高，右旋糖酐酶活力呈现增加趋势，pH 5.0时酶活力最高；随后右旋糖酐酶活力出现降低趋势。该右旋糖酐蔗糖酶的最适反应温度为pH 5.0。

图2pH对右旋糖酐酶反应的影响

2.3 右旋糖酐酶的最适反应底物浓度

图3底物浓度对右旋糖酐酶作用的影响

以不同浓度的右旋糖酐为底物进行右旋糖酐酶的酶促反应，结果见图3。随着右旋糖酐浓度的增加，右旋糖酐酶的活力增加，当右旋糖酐的浓度为2%时，酶的活力最高，随后底物浓度继续增加，而酶的活力降低。所以右旋糖酐酶水解右旋糖酐的最适底物浓度为2%。

2.4 右旋糖酐酶的热稳定性

酶液分别在45、50、55、60、65℃下放置1h，每隔10 min取样测定其残余活力，未经处理酶活力为100%，不同温度条件下，相对酶活随时间变化见图4。45℃和50℃条件下，1h右旋糖酐酶活力损失不大，相对酶活分别为98%和93%；55℃时，1 h右旋糖酐酶相对酶活下降到76%；60℃时，30 min时酶活力急剧下降到45%，1 h右旋糖酐酶相对酶活下降到29%；65℃时，20 min时酶活力急剧下降到27%。该右旋糖酐酶在50℃以下相对稳定。

图4右旋糖酐酶的热稳定性

2.5 右旋糖酐酶的酸碱稳定性

图5右旋糖酐酶的酸碱稳定性

将右旋糖酐酶酶液用不同pH缓冲液适当稀释，4℃放置24 h，测定其残余酶活力，结果见图5。酶液于pH8.0处理24 h，检测出的酶活力最高，残余酶活92%；pH 2.2残余酶活64%以上； pH 9.6残余酶活74%以上，之后右旋糖酐酶活力急速下降，pH 10.0残余酶活仅剩19%。结果说明，右旋糖酐酶在pH 2.2～9.6范围内相对稳定，具有较好的酸碱稳定性，在右旋糖酐酶的应用中具有相对宽泛的pH范围。

2.6 右旋糖酐酶底物特异性

以不同分子量的右旋糖酐作为底物进行右旋糖酐酶的酶促反应，结果见图6。随着分子量的增大，右旋糖酐酶活力增加，也就是酶的亲和力随底物分子量的增加而增强。T-10最小，T-40 和T-70相近，随后继续增大，T-10 000亲和力最大，大大高于T-1 000。右旋糖酐分子量的增大，单个葡聚糖分子的空间体积会上升，与酶蛋白分子结合的几率会增加，同时单个底物分子可进行切割的位点相应增加也会提高酶促反应的效率。这样有利于右旋糖酐酶降解制备低分子量的右旋糖酐产品。

图6右旋糖酐酶底物特异性

2.7 金属离子对右旋糖酐蔗糖酶活力的影响

不同金属离子对右旋糖酐酶活性影响见表1，对该酶具有激活作用金属离子是Mn2+和Ca2+， Mn2+具有显著的激活作用，Ca2+有微弱的激活作用；Ba2+和Mg2+基本不影响该右旋糖酐酶的作用；具有抑制性的离子顺序为Cu2+> Fe3> Zn2+，Cu2+抑制作用最强，对该右旋糖酐酶的抑制力接近40%。

表1 金属离子对右旋糖酐酶活力的影响

3 讨论

右旋糖酐酶是专一性地降解右旋糖酐中的1,6-糖苷键，可以将肠膜状明串珠菌发酵产生的高分子右旋糖酐酶解为一定分子量分布的右旋糖酐，用于医药等行业。从温度对右旋糖酐酶作用影响曲线(图1)可以看出，反应的最适温度为55℃，在55℃测出的酶活力远远高于其他温度，说明该右旋糖酐酶在55℃反应速率最高；酶的热稳定性显示，50℃以下比较稳定，55℃就有明显的活力损失。因此在该右旋糖酐酶用于水解右旋糖酐的温度选择是时，既要考虑酶的最适反应温度，也要考虑它的耐热性。该右旋糖酐酶作用的最适pH为pH 5.0，酶的酸碱稳定性研究表明：在pH2.2～9.6范围内相对稳定，具有良好的酸碱稳定性，在右旋糖酐酶的应用中具有宽泛的pH范围。该右旋糖酐酶作用的最适底物浓度为2%，但是这一数据是和酶浓度相关，在具体应用中需要根据实际情况进一步确定。酶的底物特异性显示酶的亲和力随底物分子量的增加而增强，尤其是对分子量1 000万以上的右旋糖酐的亲和力远远大于100万以下的右旋糖酐，这一特点有益于酶法降解高分子右旋糖酐制备一定低分子量的右旋糖酐。金属离子对酶作用应先结果表明，Ba2+和Mg2+对该右旋糖酐酶的作用基本无影响；对该右旋糖酐酶具有抑制性的离子顺序为Cu2+> Fe3> Zn2+，Cu2+抑制作用最强；Mn2+具有显著的激活作用。作用机理有待进一步研究，但在该右旋糖酐酶的应用中应注意到金属离子的影响。右旋糖酐酶的酶学性质研究，为右旋糖酐酶代替盐酸水解右旋糖酐生产医用右旋糖酐奠定基础，有助于医用右旋糖酐的生产工艺改进，提高产品品质和生产效率，降低生产企业环保符合，使医用右旋糖酐的生产绿色高效。