一起蛋鸡鸡白痢病例的病原分离与鉴定

吴旭锦，朱小甫，杨 萍，高 睿，张文娟，熊忙利，邢 蕾

(1.咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所，动物疫病分子生物学诊断实验室，陕西 咸阳 712000；2.咸阳市动物疫病预防控制中心，陕西 咸阳 712000；3.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)

鸡白痢(pullorum disease)是鸡群常见的一种重要细菌性传染病，感染范围广，经济损失大，一直是种鸡净化的重点传染病。其病原为鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，该菌为肠杆菌科、沙门氏菌属成员[1]。临床上鸡白痢沙门氏菌主要侵害2～3周龄雏鸡，引起鸡群腹泻，拉白色石灰水样稀粪，或引起败血症，死亡率较高。成年鸡主要表现为隐性感染，导致产蛋率和受精率下降，鸡苗质量不高，经济损失较大[2,3]。该病既能水平传播又能垂直传播，是沙门氏菌病防控的难点之一。抗生素在沙门氏菌病的防控中起了重要作用，但长期以来由于养殖过程中普遍存在滥用、长时间用抗生素现象，导致耐药性沙门氏菌越来越多，抗生素治疗效果不佳，给临床治疗带来了很大的困扰[4～6]。笔者从渭南市某育成鸡场发病鸡样本中分离和鉴定了一株耐药性鸡白痢沙门氏菌，为该病的进一步防治提供了思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2018年12月，陕西渭南某2万规模的育成鸡场，鸡群16日龄出现发病情况，发病雏鸡精神不振，缩颈闭眼，食欲减退，绒毛蓬松，翅膀下垂，拥挤打堆，病鸡排白色浆糊状粪便，肛门周围绒毛被粪便污染，病雏叫声尖锐，发病率约60%，病死率约90%。剖检死亡雏鸡，发现肺脏充血出血，心肌有少量白色结节，肝脏有灰白色坏死灶，胆囊充盈，盲肠肿胀，浆膜有白色结节，肾脏输尿管充满尿酸盐呈花斑样外观。鸡场先后用庆大霉素、阿莫西林、阿米卡星和复方磺胺氯哒嗪钠等药物治疗，但没有任何效果。无菌采集肝脏和脾脏，备用。

1.1.2 试剂 营养肉汤为动物疫病分子生物学诊断实验室自制；麦康凯琼脂、SS琼脂与营养琼脂为北京奥博星生物技术有限责任公司产品；药敏纸片与微生物鉴定管，杭州滨河微生物试剂有限公司产品。其他化学试剂均为国产分析纯。DNAiso、RNAiso核酸提取试剂、rTaq酶、dNTP等分子生物学试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 实验动物 健康小白鼠20只，体重35 g左右，购自空军军医大学实验动物中心。

1.1.4 引物设计 根据鸡白痢沙门氏菌invA基因(EU348368)设计了一对特异性检测引物，上游引物invA-F序列为ATCATTTCTATGTTCGTCATTC，下游引物invA-R序列为GCGGGAATCCCGGCAGAGTT，预期扩增长度为826bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 用肝脏平整的切面制作触片，干燥后用革兰氏染液进行染色，显微镜油镜观察[7]。无菌法取组织样品，划线法接种营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板和SS平板，37℃有氧条件培养12 h，待形成形态典型的菌落时挑菌接种于普通肉汤，于37℃、200 r·min-1条件下摇动培养12 h。将肉汤培养物再次琼脂平板划线，培养后选择形态特征明显的菌落，染色镜检观察，视野中为形态单一的细菌时，挑取该菌落菌种接种于肉汤摇动培养，获得的肉汤即为细菌纯培养物。

1.2.2 生化试验 在生物安全柜中将待检菌纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖与甘露醇微量发酵管，置于恒温箱37℃培养，12 h后观察结果。用接种针蘸取菌液，在硫酸亚铁培养基中穿刺接种，恒温箱37℃培养96 h，观察穿刺线周围是否变黑[8]。接种待检菌在葡萄糖蛋白胨水培养基，培养3 d后进行M.R试验，观察结果。将待检菌接种于邓亨氏蛋白胨水，培养3 d后进行靛基质试验[9]。

1.2.3 鸡沙门氏菌PCR鉴定 根据DNAiso试剂说明提取纯化菌DNA。PCR反应体系组成为DNA模板 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，invA-F、invA-R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，超纯水补足至25.0 μL。PCR条件：95 ℃ 5 min进行预变性，进入循环后94 ℃ 40 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50s，共进行35个循环，PCR结束后进行电泳观察。送PCR产物到生工生物工程(上海)有限公司西安测序部进行序列测定，并比对分析序列结果。

1.2.4 动物回归试验 取健康小鼠20只，随机分为2组，试验组和对照组各10只，试验组小鼠每只腹腔注射0.2 mL细菌肉汤，对照组小鼠每只腹腔注射0.2 mL生理盐水，每日观察发病情况。

1.2.5 分离菌的药物敏感性试验 药敏试验采用纸片扩散法。在营养琼脂平板均匀涂布菌液，待菌液吸收无可流动液体时将药敏纸片均匀贴在琼脂表面，37℃培12h后观察结果，测量抑菌环直径。

1.2.6 常见禽病毒性疾病RT-PCR检测 根据RNAiso试剂说明书提取组织病料中的总RNA，采用本实验室所建立的鸡群病原RT-PCR检测方法，对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊炎病毒进行排查[10,11]。

1.2.7 鸡场水质检测 水样为鸡场送检的窖藏水，按照中华人民共和国农业行业标准NY5027-2008进行。将水样作5倍系列稀释，选用普通营养琼脂平板培养计数。另外将水样接种于SS琼脂平板，37℃培12 h后观察。

2 结果

2.1 细菌分离与染色结果

用采集的肝脏组织制作触片，革兰氏染色镜检，镜下可见密集的革兰氏阴性小杆菌。在营养琼脂平板、麦康凯平板和SS平板上均有细菌生长，在营养琼脂平板和麦康凯平板上均形成直径1～3 mm左右大小的灰白色半透明样菌落，在SS平板上形成直径1～3 mm左右大小的顶端黑色菌落。挑取典型黑色菌落，染色镜检可见形态一致的革兰氏阴性中等大小的杆菌(图1)。

图1 细菌分离与染色镜检结果

2.2 生化试验结果

分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖产酸产气，能发酵鼠李糖、甘露醇和甘露糖产酸，不发酵乳糖和蔗糖，柠檬酸盐利用、MR、H2S试验呈阳性，VP、靛基质试验呈阴性(表1)。试验结果符合鸡白痢沙门氏菌的生化特征。

表1 分离菌生化鉴定结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“⊕”表示产酸产气。

2.3 分离菌PCR鉴定与分析

通过设计的鸡白痢沙门氏菌保守基因invA 检测引物进行PCR扩增，电泳发现成功获得了826bp的目的条带(图2)。PCR产物测序后用DNAstar软件进行比对分析，发现分离菌invA基因序列与参考菌EU348368、NC003197同源性为99%～100%，提示分离菌确为一株鸡白痢沙门氏菌。

2.4 动物回归试验结果

接种肉汤的试验组小鼠12 h内全部死亡，剖检发现死亡小鼠主要表现为肠炎，肠粘膜充血、出血，肠系膜淋巴结潮红肿大，被膜紧张，肝脏有针尖大灰白色坏死点，而对照组采食饮水正常，表现健康。动物回归试验结果提示分离菌致病性强。

图2 分离菌PCR检测结果

2.5 药物敏感性试验结果

药物敏感性试验结果表明，35种抗生素中，仅有米诺环素有抑菌环，且为中度敏感，其他34种抗生素均无抑菌环，结果表明分离到一株耐药性极强的细菌(表2)。

表2 药物敏感性试验结果

注：R为耐药，I为中敏，S为高敏。

2.6 病毒RT-PCR检测结果

经过RT-PCR检测，禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊炎病毒核酸均为阴性，提示鸡群发病与这4种病毒感染无关。

2.7 水质检测结果

在5倍稀释的水样中，细菌分布符合标准规范，进行计数。结果表明，送检水样细菌总数为1 005个·mL-1。而标准规定畜禽饮用水总菌群成年家畜不超过100个·mL-1，幼龄家畜不超过10个·mL-1。送检水细菌总数严重超标。为确定水中细菌种类，将水样接种在SS平板上，结果在SS平板上生长出密布的顶端黑色中等大小菌落，染色镜检发现细菌为革兰氏阴性中等大小杆菌，符合沙门氏菌特征。

3 讨论

随着我国蛋鸡养殖水平的不断提高，鸡场一般比较重视沙门氏菌的净化工作，鸡白痢在规模鸡场很少发生。但在本病例中，通过RT-PCR检测，排除了危害性大的4种病毒性传染病，即禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊炎病毒感染。在细菌分离时我们发现，病死仔鸡肝脏中存在大量单一革兰氏阴性杆菌，不存在其他细菌感染现象。细菌分离鉴定发现分离菌符合鸡白痢沙门氏菌的生化特征，通过PCR检测与invA基因测序分析证实分离菌确为鸡白痢沙门氏菌，动物回归试验表明分离菌致病性很强，确定了鸡白痢沙门氏菌是本次发病的病原。

药敏试验结果发现，药敏试剂盒35种抗生素中，仅有米诺环素1种抗生素中度敏感，其他34种均严重耐药，无任何抑菌环，细菌耐药性极强，十分罕见，这也是鸡场多次更换抗生素仍然效果不佳的主要原因，这一结果和国内其他地区分离菌存在相似之处，即沙门氏菌耐药性日益严峻，且以多重耐药为特点[1～3]。为阐明感染来源，通过对送检水样检测发现，鸡群饮用的窖藏水细菌严重超标，为标准的10倍左右。分离细菌发现，水中主要存在沙门氏菌污染，提示鸡群发病和水质不洁密切相关，鸡群饮用水被沙门氏菌严重污染是鸡群发病的根本原因。明晰病因后，通过严格的饮水消毒和使用敏感药物，鸡群死亡得到了控制，随后建议鸡场弃用窖藏水，改用自来水，定期检测水质和消毒。在养殖过程中严格控制抗生素的使用，必须使用时进行药敏试验，避免盲目用药，减少经济损失的同时避免细菌耐药性的产生。