Survivin-shRNA对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞增殖、凋亡、侵袭性及凋亡蛋白的影响

秦 静 张 坚 段大鹏 张 乐

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)原发于视网膜，好发于儿童，是1种眼内的恶性肿瘤，危害性极大[1]。视网膜母细胞瘤治疗手段虽多，但多数患者预后仍差[2-3]。既往研究已证实Survivin基因与恶性肿瘤的发生、发展有密切关系，因此本实验通过构建重组腺病毒载体Survivin-shRNA并转染至HXO-RB44细胞后，检测细胞增殖活性、凋亡指数、侵袭性以及PCNA、CAS-3蛋白的表达水平，从而评估其对视网膜母细胞瘤的影响，研讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验细胞株

视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞(购自中科院上海细胞库)。

1.2 主要实验试剂及仪器

胎牛血清、双抗，美国Gibco公司；CAS-3、PCNA，美国Sigma公司；凋亡试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司；显微镜成像系统，德国Leica公司。

1.3 HXO-RB44细胞培养

从液氮中取出先前冻存的活细胞，置水浴箱中，使其快速融化。吸出细胞悬液后加入培养液中，离心、吹打后移至含10%～15%胎牛血清、100 μg/ml双抗的培养液中培养。80%～90%细胞贴壁时传代。

1.4 Survivin-shRNA构建及转染

shRNA序列由上海吉凯公司设计合成，采用腺病毒介导，构建Survivin-shRNA载体，在6孔板中接种HXO-RB44细胞，待60%～80%细胞生长融合时转染。重组Survivin-shRNA转染HXO-RB44细胞后以1∶5的比例传代。按照不同处理方法分为Survivin-shRNA组、GFP组和CON组。

1.5 HXO-RB44细胞增殖抑制率检测

对数生长期的HXO-RB44细胞计数后接种于96孔培养板中，重复4孔，同时设对照组。培养24 h后加20 μlMTT，再继续培养4 h，每孔加150 μl DMSO。在平板震荡器中震荡10 min。应用酶联免疫检测仪，于490 nm波长处测定吸光度(OD)值，以空白对照孔OD值调零。按照公式计算细胞增殖抑制率：(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.6 细胞凋亡率检测

应用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术，检测HXO-RB44细胞凋亡率。取对数期生长的HXO-RB44细胞接种于细胞培养板，细胞密度约为105/ml。HXO-RB44细胞用胰酶消化后，1 500 rpm离心5 min。收集细胞用PBS重新悬浮细胞并调节细胞浓度。取100 μl HXO-RB44细胞悬液，在1 500 rpm离心5 min，然后加入500 μl的1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI，室温下避光反应5～10 min后上流式细胞仪分析。

1.7 Transwell侵袭小室实验测细胞侵袭力

将Matrigel胶铺于培养小室滤膜上，每孔20～30 μl,37 ℃过夜凝胶，在膜的另一面涂上纤维粘连蛋白，约5×105细胞/ml 200 μl加入小室内，培养24 h后擦去膜上层细胞，将膜取下，甲醛室温固定30 min，苏木精染色，乙醇逐级脱水，二甲醛透明后，用刀片裁下膜，置于载玻片上，镜下计数。

1.8 Western blot检测HXO-RB44细胞PCNA、CAS-3蛋白表达

培养的HXO-RB44细胞同步化后，提取HXO-RB44细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部结束电泳，入电转缓冲液平衡5 min后转膜。然后抗原抗体反应，并用辣根过氧化物酶化学增强剂显色反应。采用GAPDH进行标化，然后通过软件进行灰度扫描及定量。

1.9 统计学处理

应用SPSS 18.0软件包进行数据统计，多组样本比较采用单因素方差分析检验。

2 结果

2.1 Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞增殖的影响

MTT结果表明，Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞的生长有明显抑制作用。如图1所示，在24 h时，CON组的增殖抑制率为(7.69±1.12)%，GFP组的增殖抑制率为(8.06±1.26)%，而Survivin-shRNA组的增殖抑制率为(24.90±4.55)%，差异有显著性(P<0.05)。在48 h和72 h也有相同的趋势。另外，在CON组及GFP组中，72 h增殖率与24 h、48 h相比，差异无统计学意义 (P>0.05)，而Survivin-shRNA组中，72 h时细胞增殖抑制率可达到(43.92±6.18)%，明显高于24 h的(24.90±4.55)%和48 h时的(27.35±5.23)%，差异均有显著性(P<0.05)。

图1 各组HXO-RB44细胞增殖抑制率

2.2 Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞凋亡的影响

流式细胞术检测发现，与Control组和GFP组相比，Survivin-shRNA组HXO-RB44细胞早期凋亡率增高，差异有显著性(P<0.05)，见图2。

图2 流式细胞术检测各组HXO-RB44细胞凋亡率

2.3 Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞侵袭性的影响

transwell侵袭小室实验结果发现，与对照组相比较，Survivin-shRNA组穿膜细胞数明显减少,差异具有统计学意义 (P<0.05)，提示Survivin-shRNA能抑制HXO-RB44细胞的侵袭能力(图3)。

图3 各组HXO-RB44细胞穿膜细胞数比较

2.4 Survivin-shRNA对HXO-RB44细胞蛋白表达的影响

Westtern blot结果发现，Survivin-shRNA可降低PCNA蛋白的表达水平，并提高CAS-3的表达水平，见图4。

图4 各组HXO-RB44细胞蛋白表达水平

3 讨论

视网膜母细胞瘤在全世界发病率约为1∶20 000[4]，其发病率有逐年上升的趋势[5]，最早由Pawius报道。目前趋向于个性化综合治疗包括手术摘除眼球、化学减容法、外照射、激光、温热疗法、冷冻疗法及针对转移肿瘤的全身化疗等[6-7]。随着医学的进步，患者的生存率得到了极大地提高，但总体生存率仍低于50%[8-9]。

既往研究表明，Survivin在视网膜母细胞瘤中的特异表达，并与肿瘤的发生发展密切相关，国内外许多学者对Survivin基因与恶性肿瘤关系进行了深入研究，因此Survivin靶向治疗有可能会是1种有效的尝试[10]。基因治疗中，RNA干扰技术是其中的1种常用的方法靶向Survivin的基因干扰可阻断Survivin表达，从而抑制肿瘤细胞发生、发展及侵袭、转移[11]。靶向基因治疗具有特异性强等优点，一般不产生严重反应。

本研究结果显示，Survivin-shRNA可明显抑制HXO-RB44细胞的增殖，并且具有时间依赖性。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测结果发现，Survivin-shRNA组细胞凋亡率较Control组和GFP组明显减少。transwell侵袭小室实验结果发现，与对照组相比，Survivin-shRNA组穿膜细胞数明显减少。以上表明，Survivin-shRNA可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并抑制细胞的侵袭性生物学行为。

研究表明，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生发展密切相关，当细胞增殖增加或凋亡减少，则易致肿瘤发生发展。Caspase家族是研究细胞凋亡最常见的细胞因子，是细胞凋亡的执行者，决定了细胞凋亡的形态和生物化学改变[12]。当caspase受到抑制，使细胞凋亡障碍，就可能引起多种肿瘤的发生[13]。PCNA是DNA复制所必需的，并已被证明是肿瘤增殖1个重要的标记，Survivin的表达已被证实与视网膜母细胞瘤中PCNA和CAS-3密切相关[14-15]。我们的研究发现，敲除视网膜母细胞瘤细胞Survivin，可以下调PCNA的表达，上调CAS-3的表达，提示Survivin可能通过调节PCNA和CAS-3的表达参与视网膜母细胞瘤增殖和凋亡。

Survivin-shRNA抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并抑制其侵袭能力，其机制可能是通过调控PCNA、CAS-3蛋白的表达，激活相关细胞凋亡信号通路来完成。