宫颈癌外周血中的长链非编码RNA表达及其临床意义

谭长安 程 静

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，每年新增宫颈癌病例接近百万，且有显著年轻化的趋势[1]。寻找理想的肿瘤标志物，能促进该病的早期诊治、预后评估及指导个体化治疗，从而改善患者的预后[2]。现代研究显示宫颈癌的形成并非只由基因突变本身导致，表观遗传学修饰及其后调控基因表达水平的变化都可导致宫颈癌的发生[3]。而随着功能基因组学的发展，非编码转录产物的研究与检测得到了广泛应用。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200个碱基的非编码RNA(ncRNA)，其可在RNA 聚合酶Ⅱ的催化作用下进行转录与剪切修饰，但是不编码蛋白[4-5]。lncRNA参与细胞功能及机体代谢过程，与胚胎发育、蛋白质编码基因调控、细胞增殖凋亡、干细胞的分化、肿瘤细胞的放化疗敏感性等都有一定的相关性[6-7]。lncRNA可影响结直肠癌、乳腺癌、肝癌[8]、非小细胞肺癌[9]等肿瘤细胞的增殖、转移侵袭等生物学过程。已有学者研究显示7%的lncRNA与宫颈癌的发生发展密切相关，lncRNA的异常表达能抑制宫颈癌细胞的增殖、克隆形成能力[10-11]。但是都为从单个lncRNA分析，没有从组学方面进行综合分析。本文具体探讨了宫颈癌外周血中的长链非编码RNA表达及其临床意义，希望为宫颈癌的临床早期诊断和预后判断提供新的标志物。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2015年2月到2018年1月在我院经病理学确诊的宫颈癌患者71例为病例组，选择同期在门诊进行常规体检的健康妇女71例为对照组。纳入标准：临床与检测资料完整；病例组检测高危型人乳头瘤病毒阳性，宫颈癌临床分期为ⅠB～ⅡA；对照组宫颈薄层细胞学检测高危型人乳头瘤病毒阴性；年龄20～60岁。排除标准：合并感染性疾病以及肝、肾疾病患者；妊娠与哺乳期妇女；合并内分泌疾病、自身免疫性疾病患者。病例组中年龄最小24岁，最大54岁，平均年龄(46.39±2.22)岁；平均体重指数(22.88±1.47)kg/m2；平均病程(4.11±1.84)年。对照组中年龄最小22岁，最大56岁，平均年龄(46.11±1.48)岁；平均体重指数(22.32±2.48)kg/m2。2组入选者的年龄、体重指数对比差异无统计学意义(P>0.05)。此项研究是经我院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 外周血样本的制备

抽取2组入选者的静脉血各4 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内，于取血后2 h内进行淋巴细胞分离。将血液样本混匀后，3 500 r/min离心10 min，加入2倍体积的无菌PBS混合，然后加入室温平衡的8 ml淋巴细胞分离液中，以1 500 r/min离心20 min后，取中层的白细胞。再于-4 ℃下10 000 r/min离心5 min后于-80 ℃冰箱保存。

1.3 基因芯片分析

使用Trizol试剂提取2组外周血的总RNA，采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行检测RNA完整性，使用AgilentRNA 6000 Nano Kit检测组织总RNA经紫外分光光度计测定波长为260 nm和280 nm时的吸光度(A)值，比值为1.80～2.10者纳入研究。逆转录成cDNA，使用Cy3-dCTP标记对照组，Cy5-dCTP标记病例组。选用晶芯4×180k lncRNA V3.0检测芯片(博奥生物有限公司)，实验步骤参考芯片实验过程说明，实验过程由公司协助完成。采用LuxScan3．0图像分析软件对芯片图像进行分析，以差异为4倍的标准来确定差异表达基因。

1.4 实时荧光定量PCR

本研究对芯片检测的差异表达基因进行了实时荧光定量PCR验证，故选用GAPDH作为内参照，进行标准化处理，最终得到的比值为样品待测基因的相对值。在NCBI上查询lncRNA编号，下载得到lncRNA序列，利用primer3软件进行引物设计，有大连TAKARA公司合成，引物序列见表1。

表1 lncRNA引物序列

1.5 统计方法

选择SPSS 22.00软件对本研究的计量数据进行分析，数据报告采用均数±标准误，对比为t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 芯片体系情况

在本研究的芯片体系中，寡核苷酸芯片的外标、内标等阳性对照信号正常，阴性对照检测为阴性；漏点率不超过0.3%，平均背景值与噪音值较低，检测体系可靠，无影响数据的污染。

2.2 表达差异分析

与对照组相比，病例组患者外周血中有差异表达基因12个，其中表达下调的基因有9个，下调倍数为(11.43±1.48)；表达上调的基因有3个，上调倍数为(7.43±1.22)。见表2。

2.3 实时荧光定量PCR验证结果对比

随机挑选了4个基因进行实时荧光定量PCR验证，其检测结果与芯片检测的结果是一致的。见表3。

3 讨论

宫颈癌在我国已成为一个重要的公共卫生问题，在女性生殖道肿瘤中高居第一位，并且发病率呈逐年上升且年轻化趋势[12]。当前该病诊治的最迫切的要求是缺乏早期诊断和判断预后的可靠指标。在组成人类基因组的几十亿个碱基对中，只有1%～2%的DNA序列可编码成蛋白质，而非蛋白质编码序列占绝大多数。其中80%的基因组序列能够被转录成RNA，不过lncRNA占据基因组序列的50%左右[13]。

表2 癌外周血中的长链非编码RNA表达差异分布

表3 实时荧光定量RCR验证结果对比

lncRNA是调控非编码RNA中的一种，为不具有编码蛋白质功能的细胞内转录产物。lncRNA具有空间和时间特异性，可在表观遗传、转录及转录后水平调节基因的表达，参与机体基因转录激活与干扰、基因组印迹、X染色体失活、染色质修饰与重塑、核内运输、X染色体失活等多种生物学过程的调控，可在肿瘤发生与发展中发挥重要作用[14-15]。基因芯片技术是当前研究lncRNA表达的主要技术之一，具有覆盖全面、灵敏、准确、高效的特点[16]。有学者对12例肾癌组织及其癌旁正常组织进行差异表达谱分析，得到916个差异表达的lncRNAs，且上调的lncRNAs比下调的lncRNAs显著减少[17]。本研究采用的4×180k lncRNA V3.0检测芯片是目前涵盖lncRNA序列最全面的芯片之一，不但包括众多lncRNA数据库最新版本，还包括当前最新的848条中等长度的非编码RNA。本研究芯片检测结果显示与对照组相比，病例组患者外周血中有差异表达基因12个，其中表达下调的基因有9个，下调倍数为(11.43±1.48)；表达上调的基因有3个，上调倍数为(7.43±1.22)。当前有研究显示lncRNA可能调控着人乳头瘤病毒的致癌过程，可降低或增强致癌过程中调控靶基因、靶蛋白的表达，从而阻断或促进病变进展[18]。还有学者应用基因芯片技术对12例宫颈癌癌灶及其相应癌旁组织样本进行lncRNAs差异分析，发现14个lncRNAs表达显著下调，18个lncRNAs表达显著上调[19]。

当前肿瘤治疗面临的挑战主要是发现癌症异常表达的特定基因，并明确这些差异基因的功能。近些年发现的与宫颈癌促癌作用相关的lncRNAs主要有H19、EBIC、Linc-P21等[20]，与宫颈癌抑癌作用有关的lncRNAs主要有XLOC_010588等，改变其表达水平对宫颈癌的增殖、侵袭等生物学行为有显著的影响[21]。本研究随机挑选了4个基因进行实时荧光定量PCR验证，其检测结果与芯片检测的结果是一致的。KLF2、KLF6可共同调控EN02基因的表达，该基因定位于12号染色体，其为一种低氧应力蛋白，也为一种糖酵解酶的二聚体，可以通过增加无氧代谢提高肿瘤细胞对低氧环境的耐受性，其过度表达与恶性肿瘤的预后有显著相关性[22]。KLF8、KLF3可参与调控人类核仁素基因，其产物为核仁磷酸蛋白，可参与核糖体的合成和成熟过程，主要位于核仁中密集的原纤维区域[23-24]。有研究表明核仁素可通过减弱视网膜母细胞瘤基因、p53基因的功能而减弱细胞的凋亡过程，从而在宫颈癌的发生与发展过程中起到调控作用[25]。同时本研究的基因差异表达谱与相关报道重合率较低，主要的原因可能在于本研究采用的样本为外周血，而非组织样本，且选择的年龄比较集中。不过本研究也有一定的局限性，本研究为小样本的研究，存在一定的研究偏倚，将在下一步进行深入分析。

总之，lncRNAs基因芯片是检测宫颈癌外周血差异表达基因的一种高通量、高效、快速的检测手段，KLF2、KLF6、KLF8、KLF3可能是潜在的基因治疗靶点。