Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌组织中微小RNA-192表达及其与术后复发转移的相关性

张建林 吴 韦 林见敏

结直肠癌是1种常见恶性肿瘤，在我国发病率和病死率中，结直肠癌已经上升到第四位[1]。由于结直肠癌发病隐匿，患者在就诊时往往已经属于进展期，预后比较差，治疗结直肠癌的主要方法是结直肠癌根治术[2]。近年来，微小RNA成为肿瘤分子研究领域的重点，微小RNA参与肿瘤细胞的转移、凋亡、增殖、多药耐药等过程。已有报道显示在多种肿瘤中，微小RNA-192表达异常。体外细胞实验表明，微小RNA-192能够抑制结直肠癌细胞的转移和侵袭[3-4]。在正常组织和结直肠癌组织中，微小RNA-192存在表达差异。本文对微小RNA-192在Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌组织中表达与术后复发转移相关性进行探究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2017年1月至2018年12月的130例进行结直肠癌根除术的Ⅱ、Ⅲ期患者的新鲜标本。所有患者明确研究目的，签署知情同意书。患者术前没有进行放化疗治疗。所有患者临床资料完整。排除炎性肠病患者、家族性息肉患者、多原发癌患者。患者术后12个月内进行肠镜检查。术后每3个月或者半年，进行一次腹盆腔影像学检查以及癌胚抗原检测。75例患者术后进行辅助化疗，使用5-氟尿嘧啶。依据影像学检查、病理活检、肠镜检查或者二次手术病理学结果，3年内没有发生复发转移的81例，作为未转移复发组，3年内发生复发转移的有49例，作为转移复发组。选取无癌细胞的癌旁组织，作为对照组，共50例患者。所有标本术后放置于液氮中。患者从采取结直肠癌根除术进行治疗后，到第一次转移复发的时间，为无复发生存时间。

1.2 方法

使用cDNA反转录试剂盒、高速冷冻式离心机、实时荧光定量聚合酶链反应仪、紫外分光光度仪等材料和仪器。①将液氮中的标本进行研磨，使用Trizol试剂盒，提取标本中的总RNA。严格按照试剂盒的要求进行操作。对获得的总RNA检测吸光度，使用紫外分光光度仪。对于A260和A280的比值超过1.8的样本，检测miRNA。检测RNA的完整性，采用1%琼脂糖凝胶电泳的方式[5]。②配置反转录体系20 μl。使用无RNA酶双蒸水、酶混合物、缓冲液、反转录酶、混合引物等，在37 ℃条件下一小时，在95 ℃条件下5 min，迅速冷却后，在-80 ℃的冰箱中保存。③使用Primer 5.0软件，对微小RNA-192和内参U6引物进行上下游设计[6]。下游引物使用试剂盒中Uni-miR qPCR Primer，严格按照操作说明，在94 ℃条件下，预变性10 cm，94 ℃下的14 s，60 ℃下25 s，依次进行40次循环。设置3个反应复孔，取每个待测样本的平均值。使用内参U6，对微小RNA-192相对表达量进行标准化处理。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 未转移复发组患者和转移复发组患者的一般情况

未转移复发组患者的一般情况，包括年龄、性别、肿瘤位置、脉管癌栓、分化程度、术前CEA、N分期、TNM分期、术后辅助化疗、T分期，与转移复发组患者相比，两组数据没有明显差异(P>0.5)，没有统计学意义，见表1。

2.2 微小RNA-192在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达

130例进行结直肠癌根除术的Ⅱ、Ⅲ期患者，微小RNA-192相对表达量为0.25±0.09，无癌细胞的癌旁组织的对照组，微小RNA-192相对表达量为0.58±0.10，结直肠癌患者的微小RNA-192相对表达量，明显低于癌旁组织的对照组，两组存在明显差异(P<0.05)，具有统计学意义。未转移复发组结直肠癌患者，肿瘤组织中微小RNA-192的相对表达量为0.33±0.08，转移复发组结直肠癌患者，肿瘤组织中微小RNA-192的相对表达量为0.12±0.02，转移复发组明显低于未转移复发组，两组存在明显差异(P<0.05)，具有统计学意义。

表1 未转移复发组患者和转移复发组患者的一般情况比较(例，%)

2.3 微小RNA-192表达与结直肠癌临床病理特征的关系

根据130例结直肠癌患者肿瘤组织中的微小RNA-192表达情况，将患者分为低表达组，以及高表达组。低表达组有35例，高表达组有95例。结直肠癌患者肿瘤组织中的微小RNA-192表达，与患者的性别、年龄、肿瘤位置、脉管癌栓、分化程度、N分期、TNM分期、T分期无明显关系(P>0.05)，但与淋巴结转移有明显差异(P<0.05)，见表2。

2.4 微小RNA-192表达与患者预后的关系

微小RNA-192低表达组患者有35例，术后复发22例，占62.86%，微小RNA-192高表达组患者有95例，术后复发26例，占27.37%，微小RNA-192低表达组患者的术后复发率，明显高于微小RNA-192高表达组患者，两组存在明显差异(P<0.05)，具有统计学意义。低表达组患者术后中位无复发生存时间为(14.1±1.2)个月，高表达组患者术后的中位无复发生存时间为(18.6±2.1)个月，两组数据存在明显差异(P<0.05)，具有统计学意义。Ⅱ期患者的无复发生存率，微小RNA-192低表达患者和高表达患者没有明显差异(P>0.05)，无统计学意义。Ⅲ期患者的无复发生存率，微小RNA-192低表达患者和高表达患者，存在明显差异(P<0.05)，有统计学意义。根据Cox比例风险模型分析，影响结直肠癌患者术后复发的独立危险因素，有微小RNA-192表达和肿瘤分期。

表2 微小RNA-192表达与结直肠癌组织临床病理特征的关系(例，%)

3 讨论

临床上治疗Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌的主要方式是根治性手术切除，但术后的复发转移率仍然比较高，影响患者的生存。微小RNA是1种小分子单链非编码RNA，含有22-26个碱基，能够与相应的mRNA靶基因互补匹配，从而对该靶基因的转录翻译进行抑制，也可以与其他蛋白组成RNA诱导沉默复合体[7-8]。微小RNA在细胞迁移、凋亡、分化、增殖，以及组织生长中发挥着重要的作用。在多种肿瘤细胞的侵袭转移、发展和进展中，微小RNA也发挥着生物学作用[9-10]。在正常肾脏、肝脏、结直肠等组织中，微小RNA-192均有表达。肿瘤发生和发展过程中，微小RNA-192通过调控相关的蛋白、靶基因，从而发生作用。有认为微小RNA-192对同源异形盒2，与锌指E-盒结合的表达的调控，调节E-钙黏蛋白，从而调节结直肠癌细胞的转移和侵袭[11]。也有认为通过p53作用，在结直肠癌细胞增殖的过程中，微小RNA-192发挥作用，使用癌细胞停滞在G1和G2期[12]。本次研究显示，相比癌旁组织，微小RNA-192在患者的肿瘤组织中低表达(P<0.05)，未转移复发组的表达高于转移复发组(P<0.05)，提示结直肠癌肿瘤组织中，微小RNA-192低表达，并且可能与术后肿瘤复发转移有关。结直肠癌患者肿瘤组织中的微小RNA-192表达，与淋巴结转移相关(P<0.05)，提示在结直肠癌患者淋巴结转移中，微小RNA-192发挥着重要的作用。本次研究中，转移复发的患者，微小RNA-192低表达的无复发生存时间，比高表达的短，提示微小RNA-192与结直肠癌患者术后无复发生存时间有密切的关系。低表达组的术后复发率明显高于高表达组，进一步显示了微小RNA-192与患者术后复发的相关性，低表达微小RNA-192会促进术后复发[13-14]。肿瘤分期、微小RNA-192表达，是影响患者无复发生存时间的独立危险因素，因此对肿瘤术后复发的预测，可以采用微小RNA-192作为1个参考指标[15]。

综上所述，在Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌组织中，微小RNA-192低表达，微小RNA-192与结直肠癌患者术后复发转移有密切的关系。