2型糖尿病患者肠道菌群的变化及其与代谢指标的关系

刘枘岢 陈毅光 李雯翀 周敏华

东莞市第三人民医院内分泌科（广东东莞523326）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病与多种因素有关，其主要特征为胰岛素抵抗伴胰岛素分泌不足。代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是一组以腹型肥胖、糖脂代谢异常及高血压等多种疾病或危险因素在个体异常聚集为特征的复杂的代谢紊乱症候群。因此，临床上T2DM 患者的发病往往伴随着肥胖、血脂代谢紊乱、血压升高、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等多种代谢综合征的异常组分。肠道菌群是指在人体肠道寄居的微生物群，目前为医学研究的热点。研究表明肠道菌群与宿主的消化、营养、代谢、免疫等方面密切相关［1］。近年来的研究发现，肠道菌群不仅能通过从饮食中能量的获取方面参与肥胖的发病，还能通过慢性炎症反应、内毒素血症、胆汁酸代谢、短链脂肪酸等多种途径参与肥胖、T2DM 等代谢性疾病的发生发展［2］。因此，基于以上研究背景，本研究拟比较T2DM 患者肠道菌群的变化及其与临床相关代谢指标之间的关系，探讨肠道细菌在T2DM 的发生发展中可能存在的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组根据1999年世界卫生组织（WHO）的T2DM 诊断标准，收集2016年6月至2018年6月于东莞市第三人民医院内分泌科住院的T2DM 患者（n= 50 例），同时于体检中心收集健康人群作为对照组（n=50 例）。病例组纳入标准：（1）年龄≥18 岁，彼此之间无血缘关系；（2）病史小于10年。排除标准：（1）其他类型糖尿病；（2）合并其余内分泌疾病；（3）患有严重脏器损害及肿瘤者；（4）近期（1 个月内）服用抗生素及微生态制剂；（5）近期（1 个月内）患有胃肠、肝胆疾病者；（6）既往胃肠道手术病史。（7）有精神病史、酗酒及滥用药物者。对照组纳入标准：（1）无糖尿病等内分泌疾病及严重脏器损害；（2）近期（1 个月内）未服用抗生素及微生态制剂；（3）近期（1 个月内）无胃肠道、肝胆疾病史；（4）既往无胃肠道手术病史。本研究获得东莞市第三人民医院医学及行政伦理委员会批准。所有受试者均知晓实验的目的及意义，并签署知情同意书。患者入院后采集早晨新鲜粪便及血液标本后迅速储存于-80℃低温冰箱中用于检测。

1.2 粪便细菌总DNA的提取及实时荧光定量PCR反应本研究应用菌属16SrDNA v3 序列特异性引物，进行实时荧光定量PCR 分析，比较T2DM 患者及对照组中各目标菌属含量及比例的差异。主要操作步骤如下：（1）粪便细菌总DNA 的提取及浓度测定。粪便细菌总DNA 的提取按照QIAamp DNA Stool Mini Kit 粪便DNA 提取试剂盒（德国Qiagen 公司）说明书步骤进行操作，并使用Dano-Drop1000 核酸蛋白仪鉴定DNA 的浓度。（2）引物的合成。本研究所用引物参考文献1 并由上海翼和应用生物技术有限公司合成。（3）标准品的构建及实时荧光定量PCR 反应。分别以目标细菌的16SrDNA v3 区进行PCR 扩增，扩增产物经电泳后回收作为DNA 标准品。将标准品稀释成浓度梯度为101～107copies/μL 的DNA 样品作为阳性模板，以不加DNA 模板的水作为阴性对照进行实时荧光定量PCR 反应。按标准曲线制作时各菌属的反应条件，反应体系在Roche LightCyder480 定量PCR 仪进行荧光定量扩增。由相关软件分析处理数据，直接可得到各样本目标菌属的含量，最后结果以细菌拷贝数的常用对数/g 粪便（lg copies/g 粪便）表示。

1.3 临床代谢指标的检测临床代谢指标主要包括查体及生化指标的检测。查体资料包括体质量、体质量指数（body mass index，BMI）、身高、腰围、血压等方面，均由我科室医护人员严格测量取得。生化指标的检测：抽取空腹静脉血进行血糖、血脂及肝功的检测，主要包括空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（glycolated hemoglobin-1，HbAlC）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（1ow density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）及谷氨酰转肽酶（glutamyl endopeptidase，GGT）等指标。

1.4 饮食结构的问卷调查本研究对全部研究对象以面对面问答形式进行问卷调查。饮食摄入量表采用食物频率问卷（FFQ）调查法。FFQ 依据2016年中国营养学会制定的《中国居民平衡膳食宝塔》，将食物分类进行调查。

1.5 统计学方法所有数据均由SPSS 21.0 统计软件进行分析。计数资料用例（%）表示，计量资料表示为（）。组间比较时计数资料采用χ2检验，计量资料采用Mann-WhitneyUtest 检验。相关性分析采用Spearman 相关。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般资料分析所有研究对象的一般资料如表2所示。本研究共纳入了100 例研究对象，其中T2DM 组50 例，对照组50 例。结果显示T2DM 组及对照组间性别、年龄无显著性差异，具有组间可比性（P＞0.05）。T2DM 组与对照组比较，BMI 及DBP 较高，FBG、HbA1C、TC、TG、LDLC、AST、ALT 亦明显升高，而HDL-C 却有所下降（P＜0.05）。在饮食结构上，T2DM 组在每日碳水化合物及脂肪摄入量占总热量比例较对照组显著升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组间菌属量的差异T2DM 组及对照组实时荧光定量PCR 各菌属的拷贝数结果如表2所示。结果显示，与对照组比较，T2DM 患者柔嫩梭菌类群、肠球菌属、大肠杆菌属含量显著性升高（P＜0.05），而拟杆菌属、双歧杆菌属及乳酸杆菌属含量显著性降低（P＜0.05）。两组在球形梭菌类群、普氏菌属方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 两组间各菌属占总细菌比例的差异T2DM组及对照组实时荧光定量PCR 各菌属比例如表3所示。结果显示，与对照组比较，T2DM 患者柔嫩梭菌类群、肠球菌属、大肠杆菌属显著性升高（P＜0.05），而拟杆菌/球形梭菌、双歧杆菌属显著性降低（P＜0.05）。两组在普氏菌属、乳酸杆菌属方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 T2DM 组及对照组间一般资料的比较Tab.1 Comparison of general data between T2DM group and control group±s

表1 T2DM 组及对照组间一般资料的比较Tab.1 Comparison of general data between T2DM group and control group±s

临床指标性别（男/女）年龄（岁）病程（年）BMI（kg/m2）腰围（cm）SBP（mmHg）DBP（mmHg）FBG（mmol/L）HbA1C（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）AST（IU/L）ALT（IU/L）GGT（IU/L）总热量（kcal/日）碳水化合物（/总热量）脂肪（/总热量）蛋白质（/总热量）每周至少饮用一次酸奶（n，%）T2DM 组（n=50）30/20 58.44±11.40 5.50±2.59 24.93±2.98 87.18±10.21 124.84±12.91 79.48±11.88 9.92±2.79 8.53±2.21 4.85±0.72 2.35±1.06 1.02±0.17 3.07±0.32 41.78±14.84 42.28±16.92 36.02±14.35 1 728.75±352.33 0.62±0.04 0.26±0.04 0.13±0.01 11（22.0）对照组（n=50）27/23 54.76±10.76-23.02±1.90 83.94±8.54 119.70±10.79 73.78±7.97 4.99±0.56 5.51±0.51 4.24±0.61 1.40±0.20 1.13±0.13 2.92±0.11 26.22±8.33 25.98±11.99 32.76±13.80 1 712.62±326.47 0.59±0.02 0.25±0.03 0.15±0.01 14（28.0）Z 值/χ2值0.367-1.655 P 值0.545 0.098-2.924-1.698-1.928-2.460-8.410-7.103-4.013-5.016-3.286-2.513-5.212-4.704-1.183-0.255-3.007-2.448-1.382 0.480 0.003 0.090 0.054 0.014＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.012＜0.001＜0.001 0.237 0.799 0.003 0.014 0.167 0.488

表2 两组实时荧光定量PCR 各菌属的拷贝数Tab.2 Copy numbers of each bacterial genus in the two groups of real-time quantitative PCR±s

表2 两组实时荧光定量PCR 各菌属的拷贝数Tab.2 Copy numbers of each bacterial genus in the two groups of real-time quantitative PCR±s

细菌属球形梭菌类群柔嫩梭菌类群拟杆菌属普氏菌属双歧杆菌属乳酸杆菌属肠球菌属大肠杆菌属lg copies/g 粪便细菌数T2DM 组7.09±0.46 5.83±0.40 6.81±0.40 5.12±0.88 4.68±0.92 3.51±0.98 4.71±0.62 1.70±0.42对照组7.01±0.49 5.54±0.39 7.55±0.77 4.81±1.00 5.21±0.96 3.88±0.82 4.35±0.48 1.34±0.69 Z 值-0.810-3.396-4.764-1.499-2.620-2.058-2.672-2.210 P 值0.418 0.001＜0.001 0.134 0.009 0.040 0.008 0.027

2.4 肠道菌群与临床代谢指标间的关系本研究进一步研究了肠道菌群与临床代谢指标间的关系。研究结果如表4显示，柔嫩梭菌类群与FBG、HbA1C 及AST 均成显著性正相关；拟杆菌属与多种代谢指标FBG、HbA1C、TC、TG、LDL-C、AST 及ALT 均呈负相关；乳酸杆菌属与BMI、FBG 呈负相关，与HDL-C 呈正相关；肠球菌属与HbAIC、AST、ALT 均呈正相关；大肠杆菌属与TC、ALT 呈正相关；拟杆菌/球形梭菌%与FBG、HbA1C、ALT 成显著性负相关，而与HDL-C 呈（P＜0.05）。

表3 两组实时荧光定量PCR 各菌属比Tab.3 Ratio of each bacterial genus in the two groups of realtime quantitative PCR ±s，%

表3 两组实时荧光定量PCR 各菌属比Tab.3 Ratio of each bacterial genus in the two groups of realtime quantitative PCR ±s，%

细菌属拟杆菌/球形梭菌柔嫩梭菌类群普氏菌属双歧杆菌属乳酸杆菌属肠球菌属大肠杆菌属T2DM 组0.93±0.07 0.72±0.08 0.52±0.19 0.53±0.18 0.45±0.19 0.60±0.15 0.25±0.13对照组1.02±0.07 0.68±0.08 0.56±0.22 0.61±0.17 0.48±0.21 0.52±0.18 0.19±0.10 Z 值-5.329-2.439-0.934-2.134-0.486-2.072-2.383 P 值＜0.001 0.015 0.350 0.033 0.627 0.038 0.017

2.5 肠道菌群的与饮食结构间的关系本研究进一步研究了肠道菌群与饮食结构间的关系。研究结果如表5显示，乳酸杆菌属与碳水化合物比例呈负相关（r=-0.233，P=0.020），大肠杆菌属与蛋白质比例呈正相关（r=0.207，P=0.038）。本研究没有发现其余菌属与饮食结构间的相关性。

表4 肠道菌群与临床代谢指标间的关系Tab.4 Relationship between intestinal flora and clinical metabolic indicators

表5 肠道菌群与饮食结构间的关系Tab.5 Relationship between intestinal flora and dietary structure

3 讨论

人体肠道菌群是复杂而又相对稳定的定植微生物群落，由长期在宿主体内进化而来，它们对人体代谢营养物质、合成微量元素和矿物质、分解代谢肠道中的有害物质、抵御致病菌侵入等方面起着不可或缺的重要作用［1，3］。不少研究表明，肠道菌群对肥胖、胰岛素抵抗、糖代谢异常、血脂紊乱、高血压及NAFLD 等多种MS 症候群组分的发病具有重要的作用［4］。本研究针对目标细菌16SrDNA可变区序列设计特异性引物，对肠道菌群中球形梭菌类群、柔嫩梭菌类群（厚壁菌门）和拟杆菌属、普氏菌属（拟杆菌门）两大主要门类细菌及常见益生菌（乳酸杆菌属、双歧杆菌属）和条件致病菌（肠球菌属、大肠杆菌属）进行荧光定量PCR，比较了T2DM 和健康对照组肠道菌群构成的差异，及其与临床代谢指标之间的关系。

结果显示与对照组比较，T2DM 患者柔嫩梭菌类群含量显著性升高，而拟杆菌属含量显著性降低。两组在球形梭菌类群、普氏菌属方面比较无显著性差异。根据既往分析发现，体型消瘦者消化道中的细菌主要属于拟杆菌，而肥胖者消化道中厚壁菌更多，若减肥成功后则拟杆菌数量增加但厚壁菌数量减少；厚壁菌与拟杆菌属比较，能够从食物中获取更多的能量［5-7］。国外研究发现T2DM 患者消化道拟杆菌的数量明显减少，此外血糖水平与拟杆菌门和厚壁菌门的比例密切相关［8］。因此本研究选择两大门类中最优势的菌属（拟杆菌属/球形梭菌）比值进行比较，结果与上述类似，虽然普氏菌属无明显差异，但T2DM 患者柔嫩梭菌类群%显著性升高，而拟杆菌/球形梭菌显著性降低。进一步研究发现柔嫩梭菌类群、拟杆菌属含量及拟杆菌/球形梭菌与临床代谢指标如FBG、HbA1C、TC、TG、HDL-C 及LDL-C 都密切相关。以上结果从菌属水平表明柔嫩梭菌类群“能量富集型”的生理特性，而拟杆菌属在T2DM中可能发挥着重要的作用。柔嫩梭菌类群中大多数细菌是产丁酸盐细菌。目前研究发现肠道内细菌发酵多糖后产生的最终代谢产物为丁酸，并且在供应宿主能量和肠上皮细胞发育中发挥重要作用［9］。因此，本研究推测提示T2DM 肠道内柔嫩梭菌类群的增多可能提高了宿主从饮食中吸收能量的能力，从而与T2DM 的发生相关。拟杆菌对机体代谢有重要的作用，具有参与多糖、胆汁酸和类固醇代谢、发酵碳水化合物以及维持肠道正常生理等多种功能［10］。本研究推断从长期的角度来看，拟杆菌属的减少可能与肠道菌群的结构失衡和机体代谢紊乱有关，进而引发胰岛素抵抗或T2DM，但是其机制有待进一步研究。

目前关于肥胖、T2DM 的动物和临床研究日益增多。这些研究发现此类患者的病理状态如胰岛素抵抗、代谢性内毒素血症、系统性炎症在补充益生菌制剂后往往得到显著改善［11-12］。相关研究发现，高脂血症患者中乳酸杆菌及双歧杆菌与TC、TG 及LDL-C 成负性相关，肠道内乳杆菌和双歧杆菌降血脂的作用可能通过影响胆汁酸的肠肝循环，促使肝脏利用胆固醇合成胆汁酸而实现［13］，因此推测双歧杆菌属及乳酸杆菌属数量减少，可能通过影响脂质代谢减弱了对肠道有害菌的抑制作用，从而增加了肠壁通透性，进而引起了代谢性内毒素血症及T2DM的发生。本研究发现T2DM患者双歧杆菌属、乳酸杆菌属含量及双歧杆菌属显著性降低，而且乳酸杆菌含量与BMI、FBG 及HDL-C密切相关，其中与BMI 及FBG 成负相关，而与HDL-C 成正相关。换言之，随着肠道乳酸杆菌含量的增加，BMI 及FBG 水平可能下降，而HDL-C 水平可能升高。以上发现或许可以说明肠道益生菌在T2DM 的发病机制中的正向作用。此外，本研究还发现T2DM 患者肠道中条件致病菌肠球菌属、大肠杆菌属及肠球菌、大肠杆菌含量显著性升高。在临床上T2DM 患者院内感染常见且重要的致病菌恰为大肠杆菌和肠球菌，可引起皮肤软组织感染、尿路感染、腹腔感染以及心内膜炎和脑膜炎、败血症等疾病，甚至危及生命。这与T2DM 患者本身血糖较高，易于发生感染的疾病特征相符合。不仅如此，本研究还发现大肠杆菌属与TC 成正相关，这与既往关于高脂血症患者肠道菌群的研究类似［13］，说明随着大肠杆菌含量的增加，TC 水平可能增加，而TC 升高往往是T2DM 患者发生动脉粥样硬化的一个重要因素。其实，国外早有研究发现革兰阴性菌感染与动脉粥样硬化形成有关，前已述及，菌群失调可能造成宿主微生态屏障功能紊乱，肠壁通透性增加，内源性内毒素释放入血使得内毒素进入机体［14］，进而影响血管引起动脉粥样硬化的发生。综上所述，这些条件致病菌可能影响了脂代谢的水平，从而与T2DM 相关，进而引起血管并发症。

在临床中，T2DM 患者NAFLD 发病率较高。NAFLD 是一种代谢综合征在肝脏的临床表现，常伴随着ALT、AST 轻度升高（通常在正常上限的1.5 ～2 倍），而且肝脏与肠道关系密切。因此，本研究进一步研究了肠道菌群与肝功指标的关系。研究发现柔嫩梭菌类群、拟杆菌属、肠球菌属、大肠杆菌属及拟杆菌/球形梭菌均与ALT 和（或）AST指标相关，其中柔嫩梭菌类群、肠球菌属、大肠杆菌属与ALT 和（或）AST 成正相关，而拟杆菌属、拟杆菌/球形梭菌与ALT 和（或）AST 成负相关，以上结果或许提示肠道菌群紊乱与T2DM 患者合并NAFLD 关系密切，二者可能存在共同的发病途径。研究表示，胃肠功能的紊乱是触发NAFLD 的重要因素之一［15］。肠道菌群通过改变吸收效率、影响胆碱、胆汁酸代谢、加重胰岛素抵抗、改变肠道通透性等方面影响NAFLD 的进展［16］。

影响肠道菌群组成的其中一个重要因素为饮食，饮食因素在形成肠道菌群过程中发挥的作用远大于基因因素［17］。研究表明高脂饮食改变了肠道菌群的组成结构以及降低了丰富度与多样性；而高糖饮食的小鼠也改变了肠道菌群的结构，表现为厚壁菌门和拟杆菌的数目减少，高果糖摄入还会引起肝脏脂肪变性和启动炎性反应，最终形成NAFLD［18］。国内研究表明，通过服用益生菌制剂可以通过改善NAFLD 患者的肠道微生态失衡，提升血脂联素水平，改善血糖、血脂代谢及NAFLD患者的肝脏损伤［19］。同时，本研究发现T2DM 患者每日摄入碳水化合物（%）及脂肪（%）较对照组显著升高，存在高碳水化合物饮食及高脂饮食，并且乳酸杆菌属与碳水化合物（%）成显著性负相关，大肠杆菌属与蛋白质（%）成显著性正相关，但具体机制尚不明确。本研究推断过多的碳水化合物饮食可能抑制肠道乳酸杆菌属的增殖，而长期高蛋白饮食可能增加肠道内具有较强水解及发酵蛋白能力的细菌如大肠杆菌的增殖。本研究没有发现其余菌属与饮食结构间的相关性，考虑本研究样本量较小，覆盖菌群种类亦较少，未来需要更多的研究进一步证实。

综上，本研究发现T2DM 患者存在肠道菌群失调，并且与血糖、血脂、肝功等临床代谢指标及饮食结构关系密切，推测肠道菌群在T2DM 的发生发展中可能存在重要的作用，进而影响了T2DM 患者的各项代谢指标。由于人体内肠道菌群数量庞大且处于不断变化的动态平衡中，导致影响肠道菌群变化的因素也较多，如人体的自身因素、环境因素、饮食结构、细菌自身因素及相互作用等方面。因此本研究尚存在一些不足之处，如未能排除用药情况、不同膳食结构及环境因素等方面对研究人群肠道菌群的影响，因此未来需进一步的研究来加以论证：（1）进一步研究初诊T2DM 患者（无用药基础）中肠道菌群的变化；（2）降糖药物或降脂药物对T2DM 患者肠道菌群的影响；（3）进一步研究不同膳食结构对肠道菌群的影响；（4）补充多种益生菌对T2DM 患者代谢指标及内毒素水平的影响；（5）进一步扩大样本量及菌群种类进行研究。