荧光定量PCR比较不同季节妇女阴道主要乳酸杆菌的差异

彭国丽,吕 治,苏建荣

(首都医科大学附属北京友谊医院检验科,北京100050)

乳酸杆菌(Lactobacillus)是健康女性阴道正常菌群中的优势菌,在维持阴道自净及拮抗病原微生物感染中起着重要作用。不同人群,由于年龄、种族、地域、生活习惯的不同,阴道乳酸杆菌的种类和数量存在着差异;即使同一健康人群在不同季节、生理条件下,阴道乳酸杆菌的构成也会发生变化。国外研究显示,阴道中分离的主要乳酸杆菌有卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)、詹氏乳酸杆菌(L.jensenii)、嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)、惰性乳酸杆菌(L.iners),加氏乳酸杆菌(L.gasseri)等,不同国家或地区的报道存在较大差异,在国内尚缺乏这方面的研究数据。

本研究采用针对不同分类单元的乳酸杆菌16SrRNA基因特异性引物结合SYBRGreen I荧光定量PCR,对中国北方春夏季节和秋冬季节采集的97例健康育龄妇女阴道分泌物标本中的5种乳酸杆菌进行定量和定性检测。确定阴道乳酸杆菌的种类及数量,并比较不同季节,阴道乳酸杆菌分离率和数量的差异。

1 材料与方法

1.1 试剂

硅胶膜型基因组DNA提纯试剂盒,北京赛百盛基因技术有限公司产品。PCR Taq Mix,广州东盛生物科技有限公司产品。SYBR Green I Premix Ex TaqⅡ荧光定量检测试剂盒(DRR081A),pMD19-T Simple Vector(D104A)TA克隆载体,E.coli DH5a感受态细胞(D9057),大连宝生物公司产品。Ampicillin(氨苄青霉素)、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚半乳糖苷),北京赛百盛基因技术有限公司产品。AxyPerp质粒 DNA小量试剂盒,AxyPerp PCR清洁试剂盒,爱思进生物技术有限公司产品。ATCC标准菌株 :卷曲乳酸杆菌L.crispatusATCC 33820、詹氏乳酸杆菌 L.jensenii ATCC 25258、加氏乳酸杆菌 L.gasseri ATCC 33323、嗜酸乳酸杆菌L.acidophilus ATCC 4356,内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室惠赠。LB、SOC、MRS、ROGSA 培养基,LB/Amp/X-Gal/LPTG 平板培养基,参照说明书自行配制。

1.2 仪器

ABI 7300型实时荧光定量PCR分析仪,DYY-10C型电泳仪,BIO-RAD凝胶成像系统。

1.3 方法

1.3.1 研究对象 分别于2008年12月-2009年2月(秋冬季节)、2009年6月-8月(春夏季节)在北京友谊医院体检的健康育龄期妇女97例(春夏季63例,秋冬季34例)。年龄18-45岁,除外淋病、梅毒等性传播疾病和细菌性、真菌性、滴虫性阴道疾病。

1.3.2 标本采集 月经结束后2-4天,用无菌棉拭子在阴道壁下1/3处旋转数次,停留30 s至拭子饱和,每根拭子饱和的分泌物体积为0.2 ml,置于无菌试管中立即送检。

1.3.3 细菌基因组DNA提取 阴道拭子在1.8 ml PBS缓冲液中振荡混匀,13 000转离心10分钟,弃上清,收集菌体。按照基因组DNA提纯试剂盒说明书提取细菌基因组DNA,-70℃冷冻保存。

1.3.4 引物合成 根据参考文献[1-4]合成乳酸杆菌属、卷曲乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌16SrRNA基因特异性引物。

1.3.5 16SrRNA基因常规PCR检测 25 μ l反应体系 ,引物各 1 μ l(10 μ mol/L)、dNTPs 200 μ mol/L 、MgCl21.5 mmol/L、KCl 50 mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、TaqDNA聚合酶1U、模板 2 μ l,超纯水补足体积。5种乳酸杆菌特异性引物、PCR反应条件及扩增产物片段大小见表1。

表1 乳酸杆菌特异性16SrRNA基因引物序列、反应条件、产物片段

1.3.6 荧光定量PCR标准品制备 将乳酸杆菌ATCC标准菌株在MRS、ROGSA培养基上进行培养。挑取单个菌落,提取细菌基因组DNA进行常规PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳检测。阳性产物切胶纯化回收,与pMD19-T Simple Vector载体进行连接反应,具体步骤按照试剂盒说明书进行。转化入E.coli DH5α感受态细胞,在X-gal/ITPG培养基上进行蓝白斑筛选。挑取带有重组质粒转化子的白色菌落在SOC液体培养基37℃振荡培养过夜。提取重组质粒测序鉴定,紫外分光光度计测定核酸浓度,确定拷贝数,连续10倍稀释后检测得到的CT值与样品浓度绘制荧光定量PCR标准曲线。

1.3.7 SYBR Green I Real-Time PCR进行细菌定量分析,通过熔解曲线分析,检测非特异性产物并对引物浓度进行优化,确定扩增产物的Tm。

1.3.8 产物分析 扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含

0.15 μ g/ml溴化乙啶)100 V 电压电泳30-40 min,全自动凝胶成像系统显像观察。符合片段大小的PCR阳性产物经切胶回收纯化后由金唯智生物科技有限公司进行测序。结果通过BLAST与Gene Bank比对验证(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

1.3.9 统计分析 用SPSS11.5进行统计学分析,两组标本乳酸杆菌分离率比较用χ2检验,乳酸杆菌数量比较用t检验。

2 结果

2.1 常规PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图1,阴道5种乳酸杆菌不同季节分离率及数量比较见表2。

2.2 健康育龄妇女阴道分泌物标本中乳酸杆菌分离率为96.9%(94/97),其中卷曲乳酸杆菌分离率最高为66.0%(64/97),其次为惰性乳酸杆菌45.4%(44/97),嗜酸乳酸杆菌40.2%(39/97),詹氏乳酸杆菌36.1%(35/97)、加氏乳酸杆菌12.4%(12/97)。

2.3 阴道分泌物标本中乳酸杆菌16SrRNA基因拷贝数104-1010copies/ml,平均值 6.21±1.28(log10copies/ml)。5种乳酸杆菌中,卷曲乳酸杆菌最多为5.09±2.98(log10copies/ml)占绝对优势,惰性乳酸杆菌数量仅次于卷曲乳酸杆菌为 3.90±1.52(log10copies/ml),两者共同构成阴道主要优势菌。詹氏乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌均可在标本中检出,但数量上不占优势。阴道中的乳酸杆菌多为1-3种(76/97,78.3%),以卷曲乳酸杆菌的数量占绝对优势。

图1 PCR产物2.0%琼脂糖凝胶电泳

表2 不同季节健康妇女阴道乳酸杆菌分离率和数量比较(Log10copies/ml±SD)

2.4 春夏季与秋冬季比较,5种阴道乳酸杆菌分离率在不同季节无明显差异(P＞0.05)。在数量上,秋冬季节妇女阴道中卷曲乳酸杆菌数量(3.62±2.75)明显低于春夏季(5.24±3.07,P＜0.05)。其他4种乳酸杆菌在不同季节的数量无统计学差异。

3 讨论

本研究显示健康育龄期妇女阴道乳酸杆菌分离率占96.9%,卷曲乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌是中国妇女阴道主要乳酸杆菌,该结果与张彦采用文库构建方法和韩国Hyeran Nam采用温度梯度凝胶电泳方法所得的妇女阴道主要乳酸杆菌构成结果相似,而与美国学者的研究存在差异[5-7]。提示人体阴道菌群的微生物构成存在地域上的差异。健康妇女阴道中一般为1-2种乳酸杆菌,且以一种占绝对优势。

国外研究显示,不同季节人体微生态环境中的细菌构成及数量会发生改变,春夏季与秋冬比较,某些细菌的数量明显增多[5,8,9]。本研究检测的5种阴道乳酸杆菌分离率在不同季节无显著性差异(P＞0.05)。说明环境气候因素不能对人体的阴道乳酸杆菌构成产生决定性影响。然而,本研究中的卷曲乳酸杆菌数量在春夏季节明显多于秋冬季节(P＜0.05),是唯一在不同气候条件下数量发生明显改变的阴道乳酸杆菌,其他4种乳酸杆菌数量在不同季节无显著性差异(P＞0.05)。卷曲乳酸杆菌是产过氧化氢能力最强的乳酸杆菌之一,在维持阴道自净及拮抗病原微生物感染中起着重要作用。阴道卷曲乳酸杆菌数量季节性发生显著性变化提示我们,该菌是一种对人体微环境变化非常“敏感”的细菌,由于其在阴道防御机制中的重要作用,必然会对阴道中的其他细菌产生影响。因此,研究产生这种变化的原因对于我们认识阴道益生乳酸菌与阴道细菌性疾病发病机理具有重要意义。

本研究采用荧光定量PCR结合16SrRNA基因、TA克隆技术比较不同季节育龄妇女阴道分泌物中5种主要乳酸杆菌的构成和数量变化。传统细菌分离培养技术在标本采集、运送、接种上均有较严格的要求。而提取细菌基因组DNA可以长期保存,集中检测,PCR方法即可检测活的可培养细菌,也可检测无法培养的细菌,在对未知的病原菌的检测上也具有广泛的应用前景。细菌16SrRNA基因,存在于所有细菌及衣原体等原核生物的染色体基因中,其特点是多拷贝、多信息、长度适中,是细菌鉴别、分类的金标准。分子生物学技术的综合应用为研究复杂的人体微生物环境提供了有力的工具,也为分子诊断学的应用开辟了广阔的前景。

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