结缔组织生长因子对大鼠放射性心脏损伤作用的实验研究

放射性心脏损伤(radiation induced heart disease，RIHD)即胸部肿瘤放疗引起的常见迟发性不良反应之一，可明显增加长期生存病人的死亡风险[1]。放射性心肌纤维化是RIHD的重要病理过程[2]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor， CTGF)可诱导组织发生纤维化[3-4]，然而目前研究对CTGF与放射性心肌纤维化的确切机制并不清楚。基于此，本实验观察大鼠受照射后心脏CTGF mRNA、蛋白水平随时间的变化，并分析其与RIHD发生发展的关系，为进一步治疗RIHD的实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性SD大鼠18只(12～14 周)，由山西医科大学实验动物中心提供，体重200～230 g，均给予标准大鼠饲料和洁净自来水任其自由摄取。所有实验大鼠采用随机数字表法随机分为3组，对照组(6只)：心脏不接受照射(0 Gy)；心脏照射后3个月(3M)组(6只)：心脏接受照射(20 Gy)后饲养3个月；心脏照射后6个月(6M)组(6只)：心脏接受照射(20 Gy)后饲养6个月。

1.2 RIHD模型制备 心脏照射组SD大鼠以3%戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔内注射麻醉，取仰卧位将四肢固定自制的木板上，照射野大小设3 cm×3 cm，上界在胸骨角下缘，下界为上界向剑突方向下移3 cm，左界以中线向左旁开2cm，右界为中线向右旁开1 cm。制作铅块防护肺及腹部器官，位置验证后，以直线加速照射，6Mv X线，单次照射剂量20 Gy，剂量率300 Gy/min，照射距离1 m，剂量计算点浓度2.5 cm。1.3 Masson′s三色染色 取心肌组织用10%甲醛固定，石蜡包埋后制备5 μm切片，脱蜡至水化，Masson染色后，常规脱水透明，中性树胶封固。通过全自动图像分析系统对胶原进行定量分析，计算间质胶原容积分数(CVF)。

1.4 RT-qPCR检测心肌组织CTGF和纤维粘连蛋白(FN)mRNA 按试剂盒说明用TRIzol®试剂(9108，TaKaRa，Japan)提取心肌组织的总RNA。根据制造商提供的方案合成cDNA。CTGF和FN的引物由上海生物工程有限公司设计并合成，序列：CTGF，上游：5′-CCTGACCCAACT ATGATGC-3， 下游：5′- CCCTTACTCCCTGGCTTT-3； FN，上游：5′- TCG CTTTGACTTCACCAC-3′，下游： 5′- CTTCCTCGCTCAGTTCGT-3； 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)， 上游：5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游：5′- GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。样本相对于GAPDH的倍数变化通过比较Ct法即2-ΔΔCt计算得到。

1.5 Western Blotting检测心肌组织CTGF和FN的蛋白表达 将心肌组织加入冰冷的裂解液中分离提取总蛋白，根据BCA蛋白测定试剂盒说明(Piece， Carlsbad， CA， USA)进行检测。特异性CTGF多克隆抗体(1∶400；sc-365970；Santa Cruz Biotechnology， Inc.)和FN多克隆抗体(1∶500；sc-53286；Santa Cruz Biotechnology， Inc.) 浓度(1∶2 000)，二抗浓度(1∶5 000)用Image J软件(NIH， MA， USA)分析条带，目的蛋白与内参蛋白灰度值的比即为样品目的蛋白的相对含量。

2 结 果

2.1 Masson′s 三色染色 对照组心肌纤维结构清晰，几乎无胶原蛋白染色； 3M组心肌细胞间及血管周可见胶原含量增多；而6M组心肌细胞间及血管周胶原成分比3M组增加更加明显(见图1)。图像分析系统定量分析测算心肌胶原容积分数(CVF)，3M组为(4.45±0.30 )%，对照组为(3.33±0.14 )%，两组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，6M组(5.88±0.20)%与对照组、3M组相比均有增高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图2。

与对照组比较，*P<0.01；与3M组比较，#P<0.01

2.2 大鼠心脏照射后 CTGF mRNA、FN mRNA表达水平的变化 与对照组相比， 3M组CTGF和FN mRNA表达明显增加(P<0.01)；6M组与对照组相比增加更明显(P<0.01)，且比3M组表达亦增高(P<0.01)。详见图3。

与对照组比较， *P<0.01；与3M组比较，#P<0.01

2.3 Western blot 检测蛋白表达的结果 与对照组相比， 3M组、6M组CTGF 和FN蛋白表达明显增加(P<0.01)；且6M组比3M组表达亦增高(P<0.01)。详见图4。

与对照组比较， *P<0.01；与3M组比较，#P<0.01

2.4 CTGF与心肌组织纤维化程度的相关性分析 心脏受照后随时间延长纤维化程度的CVF 指标与CTGF mRNA (r=0.959，P<0.01)、CTGF蛋白(r=0.932，P<0.01)表达均呈正相关。

3 讨 论

本研究可见，大鼠心脏被辐射3个月后心肌细胞出现变性，间质及小血管管周出现纤维化，6个月后变性加重，心肌坏死，纤维化间质及小血管管周纤维化更加明显。与既往动物实验一致，心脏被辐射可形成放射性心肌纤维化[2]。辐射引起的心肌纤维化和重塑可能引起心脏功能障碍[5-6]。

本研究发现，大鼠心脏受照射3个月后CTGF mRNA 和蛋白表达均增高，且受照射6个月后增加更明显；而细胞外基质的主要成分FN表达也有同样表现，提示CTGF有促纤维化的作用。同时本研究对心肌组织进行Masson′s 三色染色，并通过定量分析CVF，发现心脏纤维化也随辐射后时间延长进行性加重，并且心肌纤维化程度与CTGF表达水平呈正相关。以上结果均提示CTGF在RIHD的发生发展中有重要作用。

有研究证明，转化生长因子-β1(TGF-β1)参与介导多个器官纤维化病变的发生发展过程，同时也是与放射性纤维化密切相关的细胞因子[7-9]。Liu等[10]的前期研究提示，大鼠心脏在接受20 Gy 照射后，心肌组织TGF-β1mRNA 表达水平在受照射后第2周可达到高峰，第4周下降，此后逐渐升高，至第12周达到第2个高峰，但较第2周略低。提示TGF-β1不仅参与放射性心脏损伤的起始过程，而且在其发展阶段仍然起着一定的作用。在临床实验中，已有研究运用己酮可可碱和生育酚以减少放射性纤维化的发生[11]，但由于TGF-β1除了促纤维化效应，还有抗增生和抗炎症的效应，长期完全阻断TGF-β1系统势必产生严重后果[12]。TGF-β1是CTGF的诱导剂， TGF-β1的生物学作用部分由CTGF介导的，在组织纤维化中起重要作用。有研究发现，在放射性肾脏损伤、放射性肺损伤、放射性肝脏损伤的啮齿类动物模型中CTGF表达亦明显增高，说明CTGF参与了放射性纤维化的过程[13-14]。在非人的灵长类动物中，同样发现CTGF与多器官的放射性纤维化有关[15]。然而目前CTGF与放射性心肌纤维化的文献研究较少。本研究分析CTGF与放射性心肌纤维化的作用，提示CTGF在RIHD的发生发展中具有重要参与作用。

心脏被辐射可引起心肌进行性纤维化而发生心室重构，导致心功能下降。CTGF在放射性心肌纤维化的进程中起着关键作用，靶向抑制 CTGF可能对RIHD有防治作用。