实验性脑缺血损伤大鼠Nrf2/ARE信号通路相关基因NQO1、GCLC和GCLM表达的变化

胡跃强，唐 农，王启芝，李媛媛，廖泰荣，秦红玲

氧化应激(oxidative stress,OS)是脑缺血缺氧后引起大脑神经损伤的关键因素之一[1,2]。抑制OS反应，是减轻脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的重要途径。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate quinine oxidoreductase,NQO1)是人体内重要的Ⅱ相代谢酶，谷氨酰半胱氨酸连接酶(Glutamatecysteine ligase，GCL)是还原型谷胱甘肽(Glutathione tablets,GSH)的合成限速酶，其催化亚基GCLC和调节亚基GCLM是非常重要的抗氧化蛋白酶，对抗氧化应激能力的提高有重要作用。NQO1、GCLC和GCLM三者均为核转录因子-E2 相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2) 细胞抗OS反应信号重要调控通路的下游因子[3～6]，在脑I/R损伤中鲜有研究。本文我们探讨了大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带Nrf2/ARE信号通路相关蛋白NQO1、GCLC和GCLM的表达的动态变化，以阐明脑缺血后三者和脑缺血损伤的关系。

1 材 料

1.1 分组及处理 健康雄性SPF级SD大鼠80只，体重(250±50)g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(湘)2016-0002。随机将大鼠分为两组：假手术组(sham-operation，SO)、模型组(MCAO)，每组40只。每组按照再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d 4个时间点平均分为4个亚组(n=10)。分别作如下处理：假手术组(SO 组)：以假手术代替缺血再灌注，线栓只插入颈内动脉9 mm，然后正常饲养，自由饮水；MCAO组：动物行MCAO 2 h，再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d处死。

1.2 主要试剂 还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒 (上海酶联生物)；活性氧(ROS)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗鼠NQO1多克隆抗体和兔抗鼠GCLC、GCLM单克隆抗体(Abcam公司)；偶联有辣根过氧化物(HRP)羊抗兔 IgG二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；总RNA 提取试剂盒(TIANGEN公司)；PCR反应试剂盒及逆转录试剂盒Trizol reagent(Takara公司)；引物及内参均由桂林恒顺公司提供。

1.3 动物模型制备 采用大鼠大脑中动脉梗阻模型，参照Longa的线栓法进行，颈正中线切口3 cm～4 cm，钝性分离，暴露右侧胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三角区域，沿胸锁乳突肌内侧分离肌肉筋膜，暴露颈总动脉，在颈总动脉的近心端和远心端分别穿线(4-0号，硅胶包被的圆头尼龙线栓)，近心端系紧，距此节1 cm处的远心端系一松节备用，在颈总动脉近颈内动脉分叉处以微动脉夹暂时夹闭，在颈总动脉的两线间，距颈总动脉分叉处5 mm左右，剪一斜行45°小口，松开分叉处动脉夹进行插线，在栓线标记接近颈总动脉与颈内动脉分叉处或遇阻力感时停止。在大鼠造模麻醉清醒后1 h灌胃，2 h后再灌注，规定时间点处死。

2 实验检测方法

2.1 氧化应激水平检测 取再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d每个时间点各10只大鼠缺血侧皮质脑组织约50 mg，置于玻璃匀浆器中匀浆，1000×g离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书步骤检测ROS水平和GSH活性。

2.2 荧光定量PCR检测NQO1、GCLC和GCLM mRNA 既定的时间点处死大鼠，参照文献方法立即分离同侧大脑的顶叶皮质约50 mg，该区域被认为缺血半暗带区或边缘区。按照Trizol试剂盒说明书提取总mRNA试剂盒说明进行操作。提取大脑组织总RNA参考Trizol试剂盒说明书提取。(1)提取大脑组织mRNA：参考Trizol试剂盒说明书提取总mRNA。(2)引物序列：NQO1：上游：5’- ACCTTGCTTTCCATCACCAC-3’；下游：5’-AAGACC TGGAAGCCACAGAA-3’；GCLC：上游：5’- AACAAGAAACATCCGGCATC-3’；下游：5’- TTTGATGCCTCCTCATCCTC-3’；GCLM：上游：5’-AATCTTGCCTTCCT TCCCATTG-3’；5’-GGCTTCAATGTCAGGGATGCTTTC-3’；β-actin：上游：5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’；下游：5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。(3)反应体系及条件：反应体系均为10 μl，其中 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，cDNA 模板1.0 μl、上下游引物(10 pmol/μl)各0.4 μl、探针(10 pmol/μl)各0.4 μl，加无RNA 酶的水至3.2 μl，在DNA Engine Opticon TM 2连续荧光检测系统(MJ Research公司)中进行扩增反应。(4)反应条件为： 94 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃，30 s，55 ℃ 20 s 40个循环，4 ℃保存。每例样品及阴性对照均设3个平行复孔，取均值；(5)结果处理：ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)；B=CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本);K=A-B，表达倍数=2-K。ΔCT值与mRNA表达量成反比，即ΔCT值越小，表明mRNA表达量越多。

2.3 Western blot检测NQO1、GCLC和GCLM蛋白表达 参照前法取大脑的顶叶皮质约50 mg，作以下处理：(1)收集蛋白样品：使用细胞裂解液对缺血半暗带组织(100 mg)样品进行裂解，然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度； (2)电泳：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,100 ℃变性3 min，冷却到室温后，把蛋白样品(20 μg)直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内垂直电泳进行分离(120 V)；(3)PVDF转膜：使用Bio-Rad转膜装置，转膜电流为300 mA，时间为60 min；(4)封闭：转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗2 min，5%BSA37 ℃封闭60 min；(5)一抗孵育：立即加入稀释好的NQO1、GCLC和GCLM一抗(1∶50)，4 ℃孵育过夜；(6)二抗孵育：二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶100),室温孵育60 min；(7)蛋白检测：超敏ECL发光液来检测蛋白，置于X-感光盒于暗室内曝光；(8)结果处理：采用凝胶成像分析系统进行图像分析，获取各组Western blot 条带的平均光密度(OD)值，内参为β-actin，目的蛋白与内参光密度比值即为目的蛋白的相对值。

2.4 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件包处理，成组设计多样本均数的比较用单因素方差分析，多样本均数与同组均数间的比较用LDS-t检验，检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 各组ROS水平和GSH活力的比较 与SO组比较，MCAO组脑组织中GSH活力显著降低，ROS活性显著升高(P<0.05或P<0.01)(见表1、表2)。

3.2 各组NQO1及GCLC和GCLM mRNA表达的变化 实时荧光定量PCR结果显示，SO组有少量NQO1、GCLC及GCLM mRNA表达；MCAO组大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带三者表达1 d到达高峰(P<0.05或P<0.01)，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但3 d时仍保持较高表达水平(P<0.05)(见表3)。

3.3 各组NQO1、GCLC及GCLM蛋白表达的变化 Western blot检测结果表明，SO组三者均可检测到较弱的蛋白表达，MCAO 组大鼠脑缺血再灌注12 h 缺血半暗带三者蛋白表达开始升高，24 h表达达高峰(P<0.01)，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，3 d后但仍保持较高表达水平(P<0.05) (见表4、图1)。

表1 各组大鼠ROS水平比较

与SO组比较*P<0.01

表2 各组大鼠GSH比较

与SO组比较*P<0.01

表3 各组大鼠NQO1、GCLC及GCLM mRNA表达的变化

与SO组比较*P<0.05,#P<0.01

表4 各组大鼠NQO1、GCLC及GCLM蛋白表达的变化

与SO组比较*P<0.05，#P<0.01

注：1～5道分别代表SO组和MCAO组12 h、24 h、2 d、3 d

图1 NQO1、GCLC及GCLM蛋白表达的Western blot图

4 讨 论

脑缺血再灌注后神经细胞损伤，从而引起其氧化磷酸化的能力大大下降，进而使ATP的合成减少，最终导致体内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)蓄积，产生氧化应激反应。NQO1属于黄素酶，是人体Ⅱ相抗氧化酶和重要的抗氧化物质。它以NADPH为受体，催化包括ROS、辅酶Q在内的还原反应。在该酶的作用下，醌类在体内直接被还原成氢醌，减少了醌类转化产生的氧自由基，从而对醌类物质代谢引起氧化应激损伤形成一种保护机制[7]，进而维持细胞内线粒体等细胞器的膜结构的稳定。NQO1的表达受到Nrf2/ARE通路的调控，其表达量与Nrf2的表达有关[8]，在Nrf2敲除小鼠中它的表达明显减少[9]。

还原型谷胱甘肽(Glutathione tablets,GSH)是神经细胞内的重要还原性物质，具有清除自由基、稳定线粒体膜等作用，是体内重要的抗氧化剂。GCL是GSH合成关键酶，亦为Nrf2-ARE通路的Ⅱ相解毒酶，由GCLC和GCLM组成，其中前者分子量较大，负责ATP依赖性谷氨酸的γ-羧基和半胱氨酸氨基的连接形成[10]。后者分子量较小，通过直接与GCLC相互作用增加其催化效率。两者对GSH合成亦起着关键性的作用[11]，其表达下调可引起细胞GSH合成减少，清除ROS能力下降，从而促进细胞损伤[12]。Nrf2的表达增加，GCLC则随之増加，上调GCLC的表达，能够减轻有机毒物引起的氧化应激性损伤[13]。在一些诸如阿尔兹海默病、帕金森病等神经变性病当中观察到二者的表达下降，应用抗氧化剂后，两者均上调[14～16]。而在脑血管病二者表达的变化中国内外均未见报道。

本研究结果表明，脑缺血再灌注损伤后，NQO1、GCLC及GCLM表达均明显上升，进而减少ROS的形成，并使GSH合成催化效率提高，使细胞内氧化还原反应更趋于平衡，最终减轻了神经细胞的氧化应激损伤。提示大鼠在I/R损伤后，可能通过药物影响Nrf2信号通路的下游GCLC、NQO1等蛋白的表达水平而发挥抗氧化作用从而达到神经保护的作用，这可能为脑缺血再灌注损伤的治疗提供新靶点和新思路。