羧肽酶A抑制剂Latexin基因的原核表达与纯化

刘成倩，李 红，高 骏，姚惠娟，易建中，孙凤萍

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106）

Latexin蛋白是近年来新发现的一种羧肽酶A（Carboxy peptidase A，CPA）抑制剂［1］，能在体内外非竞争性地、不可逆地抑制CPA的蛋白水解作用［2］，并且在肥大细胞中表现抑制羧肽酶A活性而加强羧肽酶B活性的特性。

因Latexin基因主要表达于单核巨噬细胞中，所以单核巨噬细胞丰富的肝脏和脾脏中其表达量很高。另外，Latexin基因在心脏、前列腺、卵巢、胰腺、肾中也有高表达［3］。研究表明，Latexin蛋白可调控干细胞的生长及调节造血干细胞中多种蛋白的丰度，并且能够酶解白三烯（LTC4）、内皮素-1（ET-1）等多种炎症因子，Latexin蛋白与炎症的发展密切相关［4-5］；也有研究表明，Latexin基因的表达可能参与肿瘤的抑制［6-7］。因此，克隆和表达该基因具有重大的应用价值。

本试验从一种分化好的人肝胚细胞瘤细胞株HepG2中克隆Latexin基因，并进行高效表达研究，以期为深入探讨Latexin蛋白的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 基因、菌种及试剂

pET30a质粒、HePG2细胞、大肠埃希氏菌种DH5α、Transetta（DE3）均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所病毒课题组提供。rTaq酶及内切酶EcoRⅠ、SacⅠ和T4 DNA连接酶均购自上海皓嘉科技发展有限公司。小量质粒抽提试剂盒购自上海嘉仪生物有限公司。Western-Blot显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 引物的设计与合成及HePG2细胞总RNA的抽提

根据GenBank已发表的Latexin基因序列，利用Premier5.0软件，设计1对特异性引物（Latexin-F/R），序列为Latexin-F：ATACCGGAATTCATGGAAATCCCGCCGACC，Latexin-R：TTAGGGTTTTTGTTTATTCCAGT，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。预期扩增Latexin基因产物长度为681 bp。

按照Trizol试剂说明书进行HePG2细胞总RNA的提取。

1.3 目的基因的扩增

反转录体系 20μL：RNA模板 5μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1μL，Latexin-R 1μL（10μmol/L），DEPC水3μL，在冰上混合，65℃ 水浴5 min，冰浴2 min；之后再加入4μL 5×反转录酶 Buffer，1μL RNase，1μL反转录酶（5 U/μL），4μL DEPC水。在冰上混合，42℃ 1 h，再70℃ 5 min。

PCR反应体系50μL：模板 3μL，10×Buffer（Mg2+free）5μL，MgSO44μL，dNTP（2 mmol/L）5μL，Latexin-F/R（10μmol/L）各1.5μL，KOD-Plus酶 2μL，ddH2O 29μL。PCR反应条件：94℃ 4 min；94℃45 s，55℃ 45 s，68℃ 90 s，35个循环；最后 68℃ 延伸 10 min。

1.4 Latexin基因连入T载体

Latexin基因PCR产物回收片段与PMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，经菌落PCR及酶切鉴定阳性的克隆送往上海华大基因科技股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为PMD18-T-Latexin。

1.5 Latexin基因表达载体的构建与鉴定

利用内切酶EcoRⅠ和SacⅠ分别对PMD18-T-Latexin质粒和PET-30a质粒进行双酶切，Latexin基因双酶切产物和PET-30a载体连接，连接物转化大肠杆菌TOP10。将菌落PCR和酶切鉴定为阳性的质粒送往上海华大基因科技股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为PET-30a-Latexin。

1.6 PET-30a-Latexin重组菌诱导表达

将测序正确的质粒PET-30a-Latexin转化感受态细胞Transetta（DE3），涂Kan+板，37℃培养过夜。在超净台内挑取单菌落接种到含Kan+的LB液体培养基中，37℃220 r/min振摇16 h，1∶100稀释到含Kan+的LB液体培养基中，37℃220 r/min振摇约2 h，测其OD值。当OD600达0.4左右时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37℃继续诱导5 h，收集菌体。

1.7 重组菌大量诱导及可溶性分析

菌液培养的方法同1.6节，再取1 mL PET-30a-Latexin菌液接到100 mL LB中，37℃振摇培养约2 h至OD600达0.4左右时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，再37℃振摇培养5—7 h，取出菌液5 000 r/min离心8 min，弃上清，沉淀加入15 mL PBS悬浮，同样的转速离心，弃上清，之后菌体加入超声波液悬浮，经超声破碎，8 000 r/min离心10 min，上清液保留备用，沉淀用10mL PBS悬浮，超声后上清液和悬浮后的沉淀分别加入5倍上样缓冲液，煮沸5 min，之后进行SDS-PAGE检测。

1.8 W estern-Blot分析

将1.7节的电泳蛋白胶按半干转移法转PVDF膜，条件是电流60 mA，转印时间约50 min。加入5%的脱脂奶粉封闭30 min，以抗His标签鼠单克隆抗体为一抗孵育1.5 h，用PBST洗涤3次，每次5 min［8］；再用山羊抗小鼠IgG HRP标记的二抗孵育1.5 h，用PBST洗涤3次，每次5 min，最后用PBS洗涤1次；加入底物在暗房内曝光显影。

2 结果与分析

2.1 目的片段的PCR扩增

以抽提的HePG2细胞总RNA为模板，以Latexin-F/R为引物进行RT-PCR扩增，得到的扩增条带为681 bp，与预期相符（图1）。

2.2 pMD18-T-Latexin菌落PCR筛选

Latexin基因的PCR产物回收片段与T载体连接转化后，挑取6个大而圆的菌落按照菌落PCR筛选方法进行扩增，结果见图2。取阳性菌测序，测序结果经比对后显示为正确。

图1 Latexin基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Latexin gene

图2 pMD18-T-Latexin菌落PCR筛选结果Fig.2 PCR screening results of pMD18-T-Latexin colony

2.3 重组原核表达载体的构建及双酶切鉴定

质粒pMD18-T-Latexin与pET-30a酶切连接转化后，通过初步筛选，将阳性克隆命名为pET-30a-Latexin，重组质粒pET-30a-Latexin经EcoRⅠ、SacⅠ双酶切后出现5 422 bp和681 bp的条带，与理论值相符（图3），表明重组质粒pET-30a-Latexin构建成功。

2.4 重组蛋白的诱导与可溶性分析

重组菌pET-30a-Latexin诱导后，经10%的SDS-PAGE电泳分析，明显可见一条约32 ku大小的新生条带（图4），且目的蛋白在超声后的上清液中，说明重组蛋白为可溶性蛋白。

图3 重组质粒的双酶切结果Fig.3 Double digestion results of recombinant plasm id

图4 pET-30a-Latexin重组菌的诱导表达Fig.4 Induced expression of pET-30a-Latexin recombinant bacterium

2.5 重组蛋白的W estern-Blot分析

纯化后的蛋白先进行10%的SDS-PAGE电泳，再转PVDF膜，暗房内曝光显影后在32 ku处有一目的条带（图5），表明重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。

图5 重组蛋白的W estern-Blot分析结果Fig.5 W estern-Blot analysis of recombinant protein

3 讨论

CPA为外肽酶，具有从羧基端降解肽链的肽酶活性，Latexin蛋白可在体外抑制CPA的蛋白水解作用。关于Latexin蛋白功能的研究报告目前还不是很多，主要为对干细胞的调节作用及对炎症及肿瘤抑制的应用方面。李圣青等［5］研究表明，大鼠急性肺栓塞后肺泡巨噬细胞（AMs）中Latexin蛋白的表达显著升高，CPA3的酶解作用被抑制，促进了肺部炎症的发展和肺血管的收缩。Takaishi等［6］研究发现，在白血病和淋巴瘤患者血中Latexin蛋白的表达水平比正常人有明显降低，说明Latexin蛋白很可能参与了癌变过程。Yong等［7］研究表明，Latexin蛋白可以抑制人胃癌细胞生长，提示Latexin蛋白的表达可能参与肿瘤的抑制。Muthusamy等［9］研究表明，Latexin蛋白在黑色素瘤细胞系的外源表达对肿瘤细胞的增殖有显著抑制作用。这些研究结果都揭示了Latexin蛋白的抗癌潜力。家禽的肿瘤性疾病是一类流行于世界范围内的禽类传染病，其研究不仅在家禽生产上具有重要意义，而且还可以作为人类癌症研究的动物实验模型。近几年来，家禽肿瘤病的研究也日益受到重视。因此，克隆和表达该基因对研究家禽肿瘤病具有一定的意义。

本试验通过克隆得到Latexin基因，经过表达条件的优化实现了重组基因的高效表达，且表达的蛋白为可溶性的，经纯化得到较纯的目的蛋白，获得的Latexin蛋白后续制备的抗体可为禽类肿瘤性疾病的临床应用研究奠定基础。