基于SRAP分子标记的铁皮石斛遗传多样性分析

杨 贞，蔡友铭，张永春，杨柳燕，王艺程

（上海市农业科学院林木果树研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海201403）

石斛属（Dendrobium）是兰科的第二大属，大约有1 100种［1］，其中，我国石斛属植物有78种［2］。石斛属中的药用石斛有39种，2010版《中华人民共和国药典》收载了石斛和铁皮石斛。铁皮石斛（Dendrobium officinale）为多年生草本植物，具有重要的药用价值，广泛分布于安徽、浙江、福建、江西、湖南、广东、广西、云南、四川、湖北、河南等省。铁皮石斛具有增强免疫、抗疲劳、消除肿瘤、抑制癌症、抗衰老、抗氧化、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、降血脂、抗胃溃疡、抗肝损伤、滋阴清热、润肺止咳等药用价值［3-6］，对治疗白内障、糖尿病和心血管疾病也有显著的效果。

铁皮石斛种子在自然状态下的萌发率很低，因此其组织培养、快速繁殖、人工栽培技术备受关注，并逐渐发展成熟。随着铁皮石斛产业的发展，因组培苗来源不同等原因在繁育栽培过程中已出现铁皮石斛品种混杂现象，同一产区及不同产区的铁皮石斛品质差异较大。

相关序列扩增多态性（SRAP）是一种基于PCR的分子标记技术，较RAPD有更好的稳定性，较ISSR有更好的多态性，较AFLP有更好的一致性［7］。通过SRAP分子标记技术可以很好地区分不同品种铁皮石斛，为铁皮石斛品种的鉴定、后代的区分、新品种的鉴定、种质资源的研究与保护提供科学依据。韩晓霞等［8］通过SSR分子标记方法对铁皮石斛实生苗中的5个优良群体进行了遗传多样性研究，结果表明：该5个群体来自2个同源基因库，其中群体B10遗传背景单一，可用于纯化育种，群体B6杂合度高，可用于种间杂交。徐蕾等［9］利用SSR技术对不同种源地的铁皮石斛进行遗传多样性分析，获得249个SSR标记位点，其中242个（97.19%）为多态性位点。周丽等［10］利用SRAP标记对黔西南州的野生铁皮石斛和相关石斛进行了研究，在扩增得到的373个条带中，有363条（97.32%）具有多态性。作为一种成熟的分子标记方法，SRAP已广泛用于植物遗传多样性、亲缘关系以及指纹图谱的构建等研究中，但有关铁皮石斛的组培苗和人工栽培苗的比较研究相对较少。本研究通过对原产于中国的铁皮石斛共13份材料进行SRAP分析，以期从分子水平揭示不同地区及相同地区铁皮石斛的亲缘关系，为铁皮石斛的分类和种质资源的保护利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

供试材料为13份来自中国不同地区的铁皮石斛（表1）。供试材料采集后，用硅胶干燥保存，带回实验室备用。

表1 供试铁皮石斛材料Table 1 Dendrobium officinale materials used in the experiment

1.1.2 SRAP引物

试验所用SRAP引物来自铁皮石斛SRAP引物［11］，正、反向引物各9条，共81对（表2）。

表2 试验所用SRAP引物Table 2 SRAP primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛基因组DNA的提取

采用生工生物（上海）股份有限公司的试剂盒（产品编号B518764）提取用硅胶干燥的铁皮石斛基因组总DNA，并用NanoDrop2000超微量紫外光检测OD260/OD280值及DNA质量浓度（ng/uL），并利用2%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.2 SRAP-PCR扩增

PCR反应总体积为25μL，其中 DNA 1 ng/μL、dNTP 0.1 mmol/L、引物0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.1 U/μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环；72℃延伸8 min。PCR扩增产物用1.5%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测，并利用凝胶成像系统观察、拍照。

1.2.3 统计与分析

电泳图谱中，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，构建二态数据矩阵。使用NTSYSpc 2.1软件计算13份材料间的遗传相似系数，并采用UPGMA法进行聚类分析，构建树状聚类图。

图1 引物M 1E2扩增的铁皮石斛SRAP产物Fig.1 SRAP products of D.officinale amp lified by primers M 1E2

2 结果与分析

2.1 SRAP引物筛选及扩增

用81对引物对铁皮石斛基因组DNA进行扩增，筛选出多态性高的引物组合15对，分别为 M1E2、M1E5、M2E2、M2E7、M3E2、M3E8、M4E2、M4E5、M4E7、M6E5、M6E9、M7E1、M7E5、M7E8、M9E1。共扩增出246条清晰可用的条带，其中有238条（96.75%）具有多态性。引物对M1E2的扩增结果见图1。

筛选的15对引物中每对引物扩增的总条带数为13—21条，平均为16.4条。引物对M1E2的扩增条带数最少，为13条；引物对M4E5的扩增条带数最多，为21条。引物对M4E7和M7E8扩增的多态性条带最多，为20条。15对引物的多态性条带比例为89.5%—100%（表3）。

表3 15对引物扩增的多态性条带Table3 Polymorphic bands amplified by 15 pairs of primers

2.2 聚类分析

将15对引物的SRAP扩增结果采用UPGMA法进行聚类分析，得到树状聚类图（图2）。13份供试材料的遗传相似系数在0.44—0.79，品种间具有较高的遗传相似性，建立的SRAP分子标记可以将13个来自不同地区的铁皮石斛品种有效区分。在相似系数0.46处，13份材料被划分为3个类群。第一类群包括14（广南）、18（湖南）、24（广东）、17（广西）、22（勐海）等 5个；第二类群包括 27（湖南）、39（广东）、33（广南）、46（浙江）、31（浙江）、45（广西）等6个；第三类群包括 53（浙江）、58（广南）等 2个。结果表明：（1）来自相同地区的铁皮石斛并没有各自聚为一类的趋势；（2）来自广南的3个铁皮石斛品种58号、33号（组培苗）和14号间的遗传距离相对较大，该3个品种分别划分在3个类群中。其中第一类群中的14号相似系数为0.73，第二类群中的33号相似系数为0.70，第三类群中的58号相似系数为0.62。另外，来自广东的24号（组培苗）和39号（组培苗）、来自湖南的18号和27号、来自广西的17号和45号也分布在不同的类群之中，表明相同地区的铁皮石斛也具有很好的遗传多样性。（3）来自浙江的31号和46号位于第二类群，53号位于第一类群。与其他地区相比，浙江种源的铁皮石斛在遗传上具有一定的稳定性，受人工栽培种质漂移的影响较小。综上所述，SRAP分子标记手段可以揭示不同地区及相同地区铁皮石斛间的遗传变异水平。

图2 基于SRAP遗传关系的13份铁皮石斛材料聚类图Fig.2 Cluster map based on SRAP genetic relation of 13 D.officinale materials

3 讨论与结论

近年来，SRAP分子标记方法已广泛应用于各物种的遗传多样性、种质资源、药用植物鉴别等研究中，如南瓜［12］、油菜［13］、香蕉［14］、小麦［15］、三色堇［16］、玫瑰［17］等等。

樊洪泓等［18］利用SRAP技术对9种药用石斛进行了研究，用40对多态性引物组合将9种药用石斛有效区分为两大类。李怀志等［19］用25对SRAP引物对20份金钗石斛、霍山石斛和铁皮石斛进行研究，共扩增出86条多态性条带，并构建了特征指纹图谱。包英华等［20］对8个居群铁皮石斛进行种质资源遗传多样性分析，得到了382条多态性条带，并将8个居群分为四大类。本研究的13份材料被分为了3个大的类群，相同地区的铁皮石斛并没有各自聚为一类，但相同地区的铁皮石斛也具有丰富的遗传多样性。可见，SRAP分子标记手段可以揭示不同地区及相同地区铁皮石斛间的遗传变异水平。

本研究采用SRAP分子标记技术研究不同种源地及相同种源地的栽培种和组培苗无性系的多态性，表现出丰富的遗传多样性（96.75%），这与黔西南州野生铁皮石斛研究的多态性比率（97.32%）［9］和唐源江等［21］对国兰多态性（98.89%）的研究结果较为相近，但与王明明等对木瓜属品种研究得到的73.08%的多态性比率相差较大。这可能与不同种质资源的种间遗传关系差异有关。本研究表明：浙江产地有2个种铁皮石斛材料亲缘关系很近，而广南产地的3个铁皮石斛品种亲缘关系较远。

综上，不同地区及相同地区的铁皮石斛具有丰富的遗传多样性，利用SRAP分子标记能够有效地将它们区分。SRAP标记能够很好地从分子水平上揭示铁皮石斛组培苗及人工栽培苗种质资源的亲缘关系及其遗传背景，可用于铁皮石斛种质资源的多样性研究及品种鉴定，为铁皮石斛种质资源的保护与利用提供科学依据。