探讨HIF-1α途径介导七氟烷/异丙酚对肺癌细胞恶性程度的调节作用

崔艳田，刘东亚，韩快娟

(1.汉中市人民医院麻醉科，陕西 汉中 723000；2.西安高新医院麻醉科，陕西 西安 710075)

肺癌是严重危害人类健康的临床常见的恶性肿瘤，病程进展快，具有较高的致残率与死亡率，常给患者家庭及社会造成巨大的生活及经济负担[1-2]。因此，探索肺癌细胞恶性程度的变化与发病机制是目前研究的热点。肺癌的发病机制比较复杂，其中低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α信号通路的激活是目前研究最为深入的肺癌发生缺氧相关机制，其在膀胱癌、直肠癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5]中呈高表达，可参与调节细胞周期、血管形成、肿瘤细胞代谢、转移/侵袭、药物抵抗等诸多生物学过程[6]。已有研究[7]显示，HIF-1α显著高表达于鳞状细胞肺癌中，但是具体的作用机制尚不明确。麻醉药物对肿瘤细胞生物学功能的影响关系到肿瘤患者术后的长期转归，因而探讨麻醉药对细胞恶性程度的调节作用具有重要意义。七氟烷为一种挥发性麻醉药，不刺激上呼吸道，血气分配系数低，起效快[8]；异丙酚为静脉全麻常用药物，具有代谢迅速、高脂溶性的特点[9]。本文旨在探讨HIF-1α途径介导七氟烷和异丙酚单独或联合使用对肺癌细胞恶性程度的调节作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

非小细胞肺癌细胞系H1299，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养(HyClone公司培养，培养条件是37 ℃、5% CO2，2 d更换1 次培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代)。胰酶购自Gibco公司，抗HIF-1α抗体、抗β-actin抗体购自Abcam公司。七氟烷与异丙酚购自江苏恒瑞公司。

1.2 细胞分组与处理

将H1299细胞分为4组：空白组、七氟烷组、异丙酚组与联合组。取对数生长期的细胞，空白组不进行处理，以PBS代替。七氟烷组加入终浓度1 nmol/L的七氟烷，异丙酚组加入终浓度1 nmol/L的异丙酚，联合组加入终浓度均为1 nmol/L的七氟烷和异丙酚，孵育6 h后更换成正常培养基进行培养。

1.3 MTT法检测细胞增殖率

取对数生长期细胞按照5×104个/孔传到96孔板中，细胞处理培养24 h与36 h后，每孔加MTT 10 μL。作用4 h后，吸管洗净培养液，每孔中加入DMS0 150 μL，振荡培养10 min，充分混匀溶解后使用酶标仪在490 nm波长下测量吸光度值(OD)，计算细胞增殖率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

取对数生长期细胞1×106个/孔接种于6孔板，细胞处理培养24 h与36 h后，胰酶消化法收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次(15 min/次)。用含有10 μL Annexinv/PI 2∶1的结合缓冲液共500 μL重悬细胞，避光冰上放置30 min，采用流式细胞仪(FACSCaliburTM)进行检测分析细胞凋亡率。

1.5 Transwell小室检测细胞侵袭

细胞接种于6孔板，调整细胞浓度为1×106个/孔。细胞处理培养24 h与36 h后，在侵袭实验中，在Transwell小室上下室之间孔径为8 μm的聚碳酸酯微孔膜上铺上Matrigel溶液50 μL，聚合30 min后进行37 ℃平衡12 h。下室中加入600 μL常规培养基，将细胞加入上室，每室100 μL。培养24 h后室温下甲醛固定15 min，采用0.5%结晶紫染液，计数穿过滤膜的细胞。

1.6 Western blot检测蛋白表达

细胞处理培养24 h与36 h后，取所有细胞，加入适量细胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃、12 000 rpm离心10 min，取上清。将样品(20 μg)加入到SDS-PAGE加样孔内进行电泳，电泳后进行PVDF膜转膜，封闭2 h，分别加入抗HIF-1α抗体(1∶500)、抗β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室温孵育120 min，洗膜、显影后扫描仪成像，采用自动成像系统分析。

上述所有实验都重复3次，取3次实验的平均值作为结果数据。

1.7 统计学分析

选择SPSS 18.00软件对本研究所有数据进行分析与处理，对各组数据首先进行正态性检验，两组计量资料间的比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖率对比

细胞处理培养24 h与36 h后，七氟烷组、异丙酚组与联合组的细胞增殖率显著低于对照组(P<0.05)，联合组亦低于七氟烷组及异丙酚组(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖率对比

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与异丙酚组比较；△P<0.05，与七氟烷组比较。

2.2 细胞凋亡率对比

细胞处理培养24 h与36 h后，七氟烷组、异丙酚组与联合组的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，联合组亦分别高于七氟烷组和异丙酚组(P<0.05)。见表2。

2.3 细胞侵袭率对比

细胞处理培养24 h与36 h后，七氟烷组、异丙酚组与联合组的细胞侵袭能力显著低于对照组(P<0.05)，联合组亦分别低于七氟烷组与异丙酚组(P<0.05)。见表3。

表2 各组细胞凋亡率对比

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与异丙酚组比较；△P<0.05，与七氟烷组比较。

表3 各组细胞侵袭能力对比

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与异丙酚组比较；△P<0.05，与七氟烷组比较。

2.4 HIF -1α表达水平对比

细胞处理培养24 h与36 h后，七氟烷组、异丙酚组与联合组的细胞HIF-1α相对表达水平显著低于对照组(P<0.05)，联合组亦分别低于七氟烷组与异丙酚组(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞HIF-1α相对表达水平对比

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与异丙酚组比较；△P<0.05，与七氟烷组比较。

3 讨论

肺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，其早期诊断困难，缺乏特异性治疗手段，使得患者的死亡率一直居高不下。恶性肿瘤在生长和发展过程中，不受控制地过度生长使耗氧量显著增加，因此肺癌机体普遍存在低氧微环境，可促进肺癌细胞的生长和转移[10]。而乏氧肿瘤细胞对于放射线抵抗，是造成肿瘤治疗后复发与放疗失败的原因之一。当肿瘤细胞处于缺氧状态，会激活细胞的低氧应激反应信号转导途径，激活HIF-1α的表达。HIF-1α作为这一环节的重要转录调节因子，可成为当前肿瘤治疗研究的重要靶点之一[11]。

七氟烷和异丙酚为经典的代表性吸入全麻与静脉全麻药物，具有起效快、时效短、苏醒迅速等特点。本研究显示，细胞处理培养24 h与36 h后，七氟烷组、异丙酚组与联合组的细胞增殖率、侵袭能力均显著低于对照组，细胞凋亡率亦显著高于对照组，联合组与七氟烷组、异丙酚组对比，差异亦有统计学意义。这表明，七氟烷、异丙酚的应用都能促进肺癌细胞凋亡，抑制其增殖与侵袭，而两者的联合使用可发挥协同作用。另有研究[12]显示，七氟烷、异丙酚可呈剂量依赖性地促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，可增加肿瘤细胞对放疗的敏感性，从而发挥抗肿瘤作用。

缺氧条件是肺癌发生与发展过程中强有力的驱动因素，缺氧可诱导细胞代谢功能的改变，导致增加放疗、化疗抵抗能力。HIF-1是由α、β亚基构成一种低氧信号传递因子，低氧环境可诱导HIF-1α稳定表达，与HIF-1β形成二聚体后可参与调控肿瘤细胞增殖和转移[13]。已有研究[14]显示，HIF-1α与肿瘤的侵袭、转移、生长、增殖密切相关，是调节肿瘤细胞适应低氧的核心转录因子。miRNA沉默HIF-1α表达可以抑制Survivin基因的表达，进而抑制肺癌细胞生长，提示HIF-1α是参与调控凋亡相关基因表达的重要转录因子。另外，还有研究[15]显示，HIF-1α在神经胶质瘤中呈现高表达状况，且与患者的不良预后密切相关，可作为评价神经胶质瘤患者的预后的独立预测因子。本研究指出，细胞处理培养24 h与36 h后，七氟烷组、异丙酚组与联合组的细胞HIF-1α相对表达水平显著低于对照组，联合组亦低于七氟烷组与异丙酚组，表明麻醉药物的应用能抑制HIF-1α的表达。麻醉药物的联合使用可有效抑制HIF-1α的表达，从而发挥更好的抗肿瘤作用。目前，也有研究[8]显示异丙酚可显著抑制低氧诱导的肺癌细胞转移能力，且作用机制可能与激动α2肾上腺素能受体有关。此外，研究[9]显示，肺损伤大鼠接受七氟烷处理后，肺癌组织HIF-1α表达水平下调，提示七氟烷具有抑制肺损伤上HIF-1α通路活性和侵袭力的作用。

总之，七氟烷和异丙酚都可抑制HIF-1α途径的激活，从而发挥对肺癌细胞恶性程度的抑制作用，且七氟烷和异丙酚的联合应用具有协同作用。