葡萄酿酒皮渣中醋酸菌的分离鉴定及发酵特征

李 盈 周 莹 谭玉洁 张坤杰 刘儒圣 姜红霞

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

果醋是一种营养丰富、风味优良的酸味调味品或饮料，它兼有水果和食醋的营养保健功能，是集营养、保健、食疗等功能为一体的新型饮品，被誉为“第四代饮料”[1-2]。葡萄果醋是利用葡萄酒或葡萄酒厂的皮渣等副产物为原料，在优良醋酸菌的作用下再次发酵而成[3]，具有开胃健脾、消除疲劳、促进代谢、增强机体免疫力，祛除皮肤色斑、补血养颜、延缓衰老，解酒醒酒、助眠，降低血液的粘稠度、防治心脑血管疾病等功效，几乎适合所有人群食用[4-5]。随着人们保健意识的提高，果醋逐渐进入人们的日常生活。充分利用我国的水果资源，必将带来良好的经济效益和健康效益[6-7]。

在果醋生产中，发酵菌种是影响果醋品质的关键，是决定其产量和质量的重要因素之一[8]。国内外对醋酸菌优质菌株的选育和发酵机理等方面已有大量研究[9-11]。但目前我国用于果醋生产的主要是食醋用菌种AS1.41醋酸菌和沪酿1.01醋酸菌，用于果醋生产时，其产酸能力、耐酒精能力和产品风味都有待提高，因此，选育优良的果醋专用菌种是大力发展果醋产业的重要问题[12-14]。

本实验拟从酿酒皮渣中分离鉴定具有优良发酵产酸性状的醋酸菌，研究其发酵潜能，为果醋生产提供优质菌种资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

宁夏产赤霞珠酿酒后的葡萄皮渣。

1.2 仪器与设备

超净工作台(SW-CJ-2F)，苏州安泰空气技术有限公司；振荡培养箱(ZHLY-180S)，上海知楚仪器有限公司；电热恒温培养箱(DNP-9162BS-Ⅲ)，上海新苗医疗器械制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50FBS)，上海申花医疗器械厂；PCR仪，美国BIO-RAD公司。

1.3 培养基

富集培养基：葡萄糖2%，酵母粉2%，121℃灭菌20 min，使用前加入无水乙醇至3%。分离培养基：葡萄糖2%，酵母粉1%，碳酸钙1%，琼脂2%，121℃灭菌20 min，使用前加入无水乙醇至6%。发酵培养基：葡萄糖2%，酵母粉1%，碳酸钙1%，121℃灭菌20 min，使用前加入无水乙醇至所需浓度。

1.4 菌种的分离

1.4.1样品的富集培养 分别将3个酿酒皮渣样品NX1、NX2、NX3接入50 mL富集培养基中，30℃，140 r/min摇床振荡培养2～3 d。

1.4.2菌种初筛 将富集发酵液梯度稀释，取100 μL各稀释菌液涂布分离培养基平板，30℃恒温培养箱倒置培养48 h。挑取透明圈明显的单菌落进行多次分区划线培养，直至显微镜检测为形态单一的单菌落。

1.4.3菌种复筛 初筛菌种接种至发酵培养基中培养，取发酵液稀释后涂布平板，挑选透明圈较大的单菌落进行进一步纯化，获得产酸能力优良的菌株。所得菌株在含6%乙醇的发酵培养基中培养，测定酸生成量，对产酸稳定的菌株进行菌种保藏，备用。

1.5 菌种鉴定

接种单菌落至发酵培养基中，140 r/min，30℃摇床振荡培养24 h。挑取单菌落加入适量菌体裂解液中，80℃保温15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液作为PCR反应的模板。PCR反应引物采用细菌16S rRNA基因的一对保守引物，引物序列如下[15]：16Sf：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；16Sr：5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3'。PCR反应系体系(25 μL)：ddH2O, 17.5 μL; 10×PCR Buffer, 2.5 μL; dNTPs, 2.0 μL; 16Sf (10 pmol/μL), 1.0 μL; 16Sr (10 pmol/μL), 1.0 μL; Template, 0.5 μL; Taq DNA polymerase (5 U/μL), 0.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环后再72℃延伸10 min。反应结束后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果提交(http://www.ezbiocloud.net /eztaxon /identify)网站进行序列分析。采用MEGA 7.0软件中的Alignment Explorer程序进行多序列同源性分析，并通过该软件的邻近归并法(Neighbor-Joining)构建系统进化树(Bootstrap=1000)[16]。16S rRNA序列在GenBank中注册。

1.6 产酸量测定

挑取单菌落接种至50 mL的发酵培养基中，30℃摇床振荡培养48 h，以空白培养基为对照。取1.2 mL发酵液，6 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL加入9 mL去离子水，2滴0.1%酚酞试剂，碱式滴定管滴定，根据消耗氢氧化钠的体积，计算产酸量[17]。每隔24 h取样1次。

X：样品醋酸含量(g/100 mL)；C：标准NaOH滴定液浓度(0.05 mol/L)；v0：空白培养基消耗NaOH标准溶液体积(mL)；v1：样品消耗NaOH标准溶液体积(mL)；v2：样品体积(mL)；60为醋酸摩尔质量(g/mol)。以产酸量(g/100 mL)为纵坐标，发酵天数为横坐标绘制曲线图。

1.7 产酸特性研究

1.7.1乙醇浓度对醋酸发酵的影响 在50 mL液体培养基中，固定接种量4%，温度30℃，摇床转速140 r/min振荡培养，以2%、4%、6%、8%、10%乙醇浓度作为变量，每隔24 h测1次产酸量，直到产酸量趋于平稳或下降。每个乙醇浓度做3个平行。

1.7.2接种量对醋酸发酵的影响 在50 mL液体培养基中，固定乙醇浓度6%，温度30℃，摇床转速140 r/min振荡培养，以2%、4%、6%、8%、10%乙醇浓度作为变量，每隔24 h测一次产酸量，直到产酸量的数值趋于平稳或下降。每个接种量做3个平行。

1.7.3温度对醋酸发酵的影响 在50 mL液体培养基中，固定乙醇浓度6%，接种量4%，摇床转速140 r/min振荡培养，以27℃、30℃、33℃、36℃、39℃的温度作为变量，每隔24 h测1次产酸量，直到产酸量的数值趋于平稳或下降。每个温度做3个平行。

1.8 数据处理

使用Excel 2010进行数据处理与曲线绘制。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌的筛选结果

醋酸菌在含有碳酸钙的固体培养基上会产酸，溶解碳酸钙而产生透明圈，透明圈的大小和强弱与醋酸菌的产酸能力成正比。经过菌种初筛和复筛，获得31株能产生透明圈的菌株，其中4株菌产生透明圈所需时间较短，直径较大，编号分别为1,5,10,11。将这4株菌保存，进行菌种鉴定和发酵性能测定。

2.2 菌株鉴定

4株产酸菌菌落呈乳白色，圆形，中间隆起，边缘整齐或锯齿状，表面光滑，革兰氏染色阴性。以菌落裂解液作为PCR模板，扩增菌株16S rRNA，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图谱如图1。

图1 菌种1,5,10,11的16S rRNA基因片段1%琼脂糖凝胶电泳

上海生工测序结果表明，4株菌的16S rRNA基因序列全长分别为1 398、1 393、1 395、1 393 bp。经序列分析，结果发现4株菌均属于苹果醋酸菌(A.malorum)，其序列与模式菌株LMG1746(T)的16S rRNA基因序列同源性均大于99%。结合菌株的菌体形态特征、培养特征，将其鉴定为苹果醋酸菌[18]。根据后续发酵实验得知，菌株11的产酸效能最高，因此将菌株11的16S rRNA基因在Genbank注册，登录号为MK583489，系统发育树如图2。

2.3 菌株发酵性能研究

2.3.1乙醇浓度对醋酸发酵的影响 乙醇是醋酸菌发酵的基础物质，为醋酸菌生长代谢提供能量，在醋酸菌生长过程中乙醇被氧化成乙酸。由图3可知，当发酵时间为8天时，乙醇浓度为6%的样品产酸量达到最大值，乙醇浓度为4%的产酸量仅次于最大值；乙醇浓度为8%的样品产酸量介于中间；而乙醇浓度为2%和10%的样品，产酸量最低。这表明菌株11的最适合的乙醇浓度介于4%～6%之间，浓度太低(2%)，可能因为乙醇含量不足，醋酸菌生长过慢，但是较高的初始乙醇(10%)对醋酸菌的生长和代谢会产生一定的底物抑制作用，二者都不利于产酸量的增长[19]。

图3 乙醇浓度对产酸量的影响

2.3.2接种量对醋酸发酵的影响 由图4可知，随着发酵时间的增加，产酸量整体都处于上升的状态，第7天后趋于平稳，当接种量为6%时，产酸量最高。接种量过低，菌体整体生长势弱，产酸量低；但是接种量过高，发酵液中所含的醋酸菌量也较大，造成培养基的营养物质消耗较多，生成醋酸的底物较少，产酸量会下降。

图4 接种量对产酸量的影响

2.3.3温度对醋酸发酵的影响 温度是影响醋酸菌生长代谢的重要因素，是醋酸菌氧化乙醇生成乙酸的必要条件。在一定的温度范围内，随着温度的升高，菌体生长速度和代谢速率变快，产酸时间缩短，提高经济效率。随着温度的升高，醋酸菌的生长及产酸呈现先增长后降低最后衰亡的趋势；在耐受温度前的一段温度梯度内，菌种的生长及产酸波动幅度较小，当温度达到菌种的耐受点时，菌种生长会急剧恶化，产酸几乎停止，最后衰亡[19]。由图5可知，当温度为33℃时，产酸量随着发酵时间的增加一直处于上升的趋势，在第5天达到最高值，而当温度为36℃、39℃时，产酸量几乎趋近于零，证明温度太高会抑制醋酸菌的生长，进而使产酸量很低。当温度为27℃和30℃时，醋酸菌的产酸量曲线数值相差不大，在第3天达到最大值而后趋于平稳。

根据单因素实验的结果，设计发酵条件为乙醇浓度5%，接种量5%，温度31℃，摇床转速140 r/min，发酵7天测得菌株11的产酸量为4.2 g/100 mL。

图5 温度对产酸量的影响

3 结 论

本实验通过富集培养法从宁夏产赤霞珠葡萄酿酒后的皮渣中筛选出了31株产酸菌，其中4株菌在筛选培养基上透明圈较大，产酸能力较强。经形态特征和16S rRNA分子鉴定，确定4株菌均属于苹果醋酸菌(A.malorum)。研究了乙醇浓度、接种量、温度等因素对菌株11在发酵产酸过程中的影响，并优化发酵条件，菌株11在实验条件下产酸量可达到4.2 g/100 mL。

图2 临近归并法构建菌株11的系统发育树

醋酸菌种是决定果醋产量和质量的主要因素之一。目前，果醋酿造的优良菌株分为醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)2个属[20]。许氏醋酸杆菌(A.schutzenbachii)是国外有名的速酿醋酸菌种,也是目前制醋工业较重要的菌种之一。奥尔兰醋杆菌(A.acetisubsp.orleanensis)是法国奥尔兰地区用葡萄酒生产醋的主要菌株[12]。迄今为止，国内科研人员已经分离了多株可用于果醋生产的醋酸菌菌种[12-14, 17]，但是大多数仍处于实验室研究阶段，在生产中应用最多的果醋菌种仍然是用于食醋酿造的恶臭醋酸杆菌(A.rancens)、沪酿醋酸杆菌(A.pasteurianusHN1.01)、巴氏醋酸杆菌罗旺亚种(A.pasteurianussubsp.lovaniensis)。分离优质高效的菌株，并将所得菌种资源用于生产果醋的实际应用中，才能将科研成果转化为生产力，因此，本研究的下一步工作是将所分离筛选的菌株进行发酵果醋的应用研究。