芜湖地区结核分枝杆菌培养及耐药情况分析

陈继梅 李雪琳

芜湖市第三人民医院，安徽 芜湖 241000

结核病是全球第九大死亡原因，已成为一个严重的全球健康问题，是死亡率最高的由单病因所引起的传染性疾病。2016年，全球估计有130万结核病患者[1]，其中56%发生在5个国家:印度、印度尼西亚、中国、菲律宾和巴基斯坦。2016年中有60万新病例对抗利福平(RRTB)，这是一种最有效的一线药物，其中49万为耐多药结核(MDR-TB)，印度、中国和俄罗斯联邦[1]等三国的MDR发生率占近一半(47%)。令人担忧的情况是耐多药结核病(MDR-TB)的发病率正在升高，对人类重大挑战是广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现。XDR-TB病例和越来越多的耐多药结核病例，导致治疗结果不佳和死亡率高，在MDR/XDR-TB患者中，控制耐药性、减少传播和改善治疗结果依赖于结核杆菌药物敏感性测试(DST)[2]。本文通过回顾性分析我院结核病区痰培养阳性细菌分离情况及结核杆菌复合群者对8种抗结核药物：异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、左氧氟沙星、卷曲霉素、对氨基水杨酸钠、阿米卡星的药物敏感性进行分析，评价我院结核病患者的结核菌分离情况及耐药模式，以期对我院及我市的结核病防治提供临床资料及用药依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2015年5月—2017年11月本院结核病区住院患者，痰培养结核杆菌复合群阳性169例患者纳入研究范围，其中男134例，女35例，年龄14～85岁。培养阳性标本进一步进行菌株鉴定及药物敏感性试验，所用纳入研究的标本全部为痰标本，排除尿液、胸腹水、脑脊液等其他部位的标本。

1.2 方法

1.2.1痰液涂片镜检

患者按医嘱分别取深部痰液或肺部咳出痰液3份，即时、清晨、夜间痰液各1份，经涂片进行萋尼氏抗酸染色后显微镜镜检，抗酸染液试剂购自珠江贝索生物技术有限公司，方法参照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的标准化操作程序执行[3]。

1.2.2培养及药敏

依据中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》[4]要求，将经4%NaOH处理后的痰标本接种至酸性罗氏培养基中培养。在培养阳性病例中采用比例法进行药物敏感性试验测定(DST)[5]。我院药敏试剂共9种，包括5种一线抗结核药物：异烟肼(INH)、利福平(RFP)、利福喷丁(REF)、链霉素(S)、乙胺丁醇(EMB)及4种二线抗结核药物：左氧氟沙星(Lfx)、卷曲霉素(CPR)、阿米卡星(AMK)、对氨基水杨酸钠(PAS)等。因利福平与利福喷丁药理作用相同，以下对结核杆菌复合群统计耐药性只计入利福平。酸性培养基及药敏试剂均由珠海贝索生物技术有限公司提供。

1.3 耐药性判定

阳性标本的菌液接种于绝对浓度药敏培养基，37℃培养，4周后观察结果，最长观察6周。药敏培养基上无细菌生长或菌落数少于20个，判定为敏感，菌落数大于20个，判定为耐药。

1.4 统计方法

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，非正态分布计量资料采用中位数表示，组间比较采用秩和检验，计数资料采用卡方检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病原菌分离情况分析

我院2年间进行结核杆菌培养的痰液标本中培养阳性标本为184例，其中结核杆菌复合群阳性为169例(91.85%)，非结核杆菌复合群15例(8.15%)，经卡方检验，χ2=257.783，P=0.000，差异有统计学意义。169例结核杆菌复合群痰涂片阳性128例(75.74%)，15例非结核杆菌复合群痰涂片阳性8例(53.33%)，两者比较，差异无统计学意义(χ2=3.587，P=0.058)。

2.2 结核杆菌复合群患者一般请况分析

痰培养的标本中培养结核杆菌复合群阳性的169例患者作为研究对象,按照临床诊断分为初治和复治两组,初次进行抗结核治疗的患者为初治组，重复治疗的患者为复治组，初治患者127例,男98例，年龄15～83岁，女29例，年龄19～81岁，复治患者42例,男36例，年龄24～81，女6例，年龄31～74岁。初、复治患者在性别、年龄差异无统计学意义(因患者年龄呈偏态分布，以中位数进行统计分析)，结果见表1。

表1 初复治两组患者一般情况分析

2.3 药敏情况分析

对培养阳性标本用一线和二线共8种抗结核药物进行药敏试验， 169例结核分枝杆菌复合体，不耐药为108例，占63.91%，耐药为61例，占36.09%，经卡方检验，χ2=26.142，P=0.000。芜湖地区临床分离的结核分枝杆菌复合体虽然以敏感为主，但耐药菌株所占比例较高。结核分枝杆菌复合体对8种抗结核药物耐药率存在明显不同，组间差异有统计学意义(χ2=64.225，P=0.000),耐药率从高到低依次INF(20.71%)、S(15.98%)、RFP(14.79%)、Lfx(13.61%)、EMB(4.73%)、PAS(4.73%)、CRP(4.14%)、AMK(1.78%)，具体结果见表2。15例非结核分枝杆菌结核群对8种抗结核药物基本都耐药。

表2 169例患者总体耐药性分析

注：结核分枝杆菌对8种抗结核药物耐药率组间比较χ2=64.225，P=0.000。

2.4 初、复治患者对8种抗结核药物的耐药情况分析

根据患者治疗情况分为初治和复治两组，分别探讨两组患者对8种抗结核药物的耐药率。结果显示复治患者除异烟肼(χ2=3.571，P=0.059)，对其他7种抗结核药物的耐药率均高于初治患者，差异均有统计学意义(χ2分别为24.077、6.605、6.373、4.946、4.077、6.373、9.235，P分别为0.000、0.010、0.012、0.026、0.043、0.012、0.002)，初治患者耐药率排名前3药物依次为异烟肼、链霉素、左氧氟沙星，复治患者耐药率排名前3依次为利福平、异烟肼、链霉素，结果见表3。

表3 初、复治患者对8种结核药物耐药分析

2.5 调查对象耐药类型分析

耐药类型: 依据2006年《WHO耐药结核病规划管理指南》[6]，分为5种类型：单耐药(对任意一种结核药物耐药)、耐多药(对两种最重要的一线药物异烟肼和利福平耐药)、多耐药(除外异烟肼和利福平，对其他任意2种或以上抗结核药物耐药)、广泛耐药(XDR-TB：为耐多药结核病，加上对二线注射药物和氟喹诺酮的耐药性)、全耐药(对本室8种的抗结核药物均耐药)。对我院初、复治患者耐药率类型进行比较显示，我室初复治患者耐多药率、广泛耐药率比较差异存在统计学意义(χ2分别为6.339、8.391，P分别为0.012、0.004)，在单耐药率、多耐药率和全耐药率上不存在显著性差异(P均>0.05)，结果见表4。

表4 初、复治结核患者耐药类型对比研究[n(%)]

3 讨 论

结核病是当今世界主要的传染病之一。耐多药结核病的出现，使得目前的治疗策略变得无效，结核病控制变得越来越困难。这就需要药物敏感性测试，而不是仅仅依赖于能够识别结核杆菌的分子技术。世界卫生组织建议以经验为基础，根据患者的总体药物敏感性试验(DST)模式进行治疗。一旦实验室结果可用，世卫组织建议根据DST结果进行治疗[7]。药敏测试是确定耐药性的关键，以药敏试验为基础的个体化药物治疗方案将有助于减少耐药菌株的传播。

2015年5月至 2017年11月间我院结核病区送检痰标本经培养，共184例患者培养出菌落,经最终菌型鉴定,其中结核杆菌复合群169例(91.85%),非结核分枝杆菌15例(8.15%),两者差异有统计学意义(χ2=257.783，P=0.000)，我院痰培养分离菌株以结核杆菌复合群为主(91.85%),占绝对优势，这与我院临床诊断上相符，肺病患者中以肺结核患者为主。同时，我室检测结果显示，非结核分枝杆菌分离的比例也占到8.15%，提示临床上可能存在较多的非结核分枝杆菌引起的肺病患者。我室资料显示，结核分枝杆菌复合群患者与非结核分枝杆菌痰涂片阳性率不存在显著性差异(χ2=3.587，P=0.058)，痰涂片阳性，加上非结核分支杆菌肺病在临床症状、各种辅助检查以及影像资料特点等方面均与肺结核十分相似，无临床特异性，同时临床对非结核分枝杆菌肺部认识上不足,可能会误导医生，引起误诊，我院经DST测试，非结核分枝杆菌对8种抗结核药物基本全耐药，用抗结核药物治疗疗效非常差，临床需对迁延不愈、治疗效果差的患者加强关注，加强痰分枝杆菌培养与菌种的鉴定[8]，以鉴别诊断患者是耐药结核杆菌还是非结核分枝杆菌引起的肺病。我室对痰培养阳性标本结核杆菌用一线和二线共8种抗结核药物进行药敏试验，169例结核分枝杆菌复合体，不耐药为108例，占63.91%，耐药为61例，占36.09%，存在显著性差异(χ2=26.142，P=0.000)，芜湖地区临床分离的结核分枝杆菌复合体仍以敏感为主，但耐药菌株所占比例较高，高于沈艳[9]研究的31.6%，耐药情况不容乐观。结核分枝杆菌复合体对8种抗结核药物耐药率存在明显不同，组间比较差异有统计学意义(χ2=64.225，P=0.000)，8种抗结核药物耐药率从高到低依次INF(20.71%)、S(15.98%)、RFP(14.79%)、Lfx(13.61%)、EMB(4.73%)、PAS(4.73%)、CPR(4.14%)、AMK(1.78%)。芜湖地区与刘延梅[10]的研究在耐药顺序上有所不同，提示不同地理区域结核耐药情况可能不同[11]，需根据当地耐药流行病学的基础实施个体化结核病管理和治疗。从我院目前耐药情况来看，对异烟肼、链霉素、利福平耐药率最高，与肺结核患者常规化疗方案以异烟肼、利福平、链霉素的组合为主有关，在中国这样的高结核病负担国家，从临床标本中分离出分枝杆菌，并对结核分枝杆菌复合物进行鉴定，以及抗结核药物药敏体外试验等程序，传统的细菌培养和药敏试验方法缓慢而繁琐，这使得适当治疗延迟成为必然，在此期间，患者可能受到不适当的治疗，耐药菌株可能继续传播，并可能发生扩增耐药性[12]。

我们发现二线药物左氧氟沙星的耐药率超过了一线药物乙胺丁醇，同刘延梅研究相同[10]，提示一线药物治疗效果差，依靠经验则改用二线药物需要慎重，要考虑到本地区耐药情况。对我院初、复治患者耐药性进行比较，发现复治患者比初治患者更易产生耐药性[13], 我室检测显示复治患者除了异烟肼，对其他7种药物的耐药率均高于初治患者，差异均有统计学意义，初治患者耐药前3名依次为异烟肼、链霉素、左氧氟沙星，复治患者耐药前3名为利福平、异烟肼、链霉素，初、复治患者耐药谱存在显著不同，临床需谨慎对待，为不同的患者选择适宜的抗结核药物。初、复治患者在耐多药率、广泛耐药率存在显著性差异(χ2分别为6.339、8.391，P分别为0.012、0.004)，这与相关研究一致[14]，结核病复治患者耐药率增多与不适当的结核病治疗、不规则用药、使用传统的DST引起结核治疗的严重延误等因素密切相关[15]。特别是复治组出现1例对8种药物全耐药菌株，复治患者出现相当大比例的广泛耐药结核病例，广泛耐药结核日益增加的趋势以及糟糕的治疗结果，敲响了对广泛耐药结核的警报，警示必须加强对耐药结核患者的有效治疗和严格管理。

通过菌种鉴定及药物敏感性实验分析，芜湖地区肺结核以结核杆菌复合群致病为主，同时伴有少量非结核杆菌复合群引起的肺病，本地区结核以敏感为主，耐药结核的发生率较高，初、复治患者耐药谱存在显著不同，复治患者在耐多药率、广泛耐药率皆显著高于初治患者。通过分析，我们认为在结核控制策略中，尽可能早的进行药物敏感性检测，由于常规培养和药敏费时过长，不可避免出现药敏结果延迟，对临床治疗缺乏指导性，应扩大快速诊断方法，并在患者管理和信息联系方面进行改进，以减少治疗延误[16]。结核病控制方案需要将重点放在有效的政策上，必须在早期进行药物敏感性试验、适当的结核治疗和有效的感染控制方面采取措施[2]，在每一个新诊断的药物敏感结核病患者中合理使用药物，以防止出现耐药性。