基于NLRP3炎性体轴和NF-κB信号通路探讨加味三妙丸防治痛风性关节炎的作用及机制

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

近年来，随着人们生活水平提高，高蛋白、高嘌呤等食物摄入增多，加上饮酒、焦虑、疲劳等因素，使得体内尿酸浓度呈不断升高趋势，尿酸盐结晶沉积在关节处，最终引起痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）[1]。GA具有反复发作、疼痛剧烈等特点，尤其是急性期所致的关节疼痛及关节破坏，给患者日常生活带来了很大障碍[2]。

研究表明，在痛风发展的病理过程中，除代谢因素外，炎症与免疫机制也参与发病[3]。Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎性体轴和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路是诱发痛风性关节炎的重要通路，该两条通路的激活最终会导致白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎症因子的大量释放，是引起痛风急性发作的关键因素[4-7]。因此，以NLRP3炎性体轴和NF-κB信号通路为切入点，开发治疗GA的新药具有重要意义。

目前临床上使用的抗GA药物（秋水仙碱、非甾体类抗炎药物等），存在白细胞减少、再生障碍性贫血、肝损害等不良反应，不适宜长期服用。而中药在GA的治疗方面具有一定优势，近年来随着现代中医药的发展，研究已证实有很多自拟方，或者以经方、成方为基础进行加减的中药方剂治疗GA效果良好[8-10]。本研究在经典方三妙丸基础上，配伍除湿、解毒、通利关节的土茯苓（Smilax glabra Roxb.），组成加味三妙丸（modified Sanmiao pill，MSMP），探讨其 GA 的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 人源单核白血病细胞株THP-1由中科院上海细胞库提供。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清购于美国Gibco公司(批号：1914970)；β-巯基乙醇、MTT 购于美国 Amresco公司（批号：M0482100、1755C459）；双抗、RPMI 1640 培养基、磷酸盐缓冲液（phosphote buffered saline，PBS）购于美国Hyclone公司（批号：J170027、AD23107271、AC11223329）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购于北京Solarbio公司（批号：818E0312）；秋水仙碱购于上海阿拉丁公司（批号：G1514018）；尿酸钠（monosodium urate，MSU）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，PMA） 购于美国 Sigma-Aldrich 公司（批号：BC8R7559、SLBS0478V）；人 IL-1β ELISA检测试剂盒购于美国Thermo Fisher公司（批号：165998051）；髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、NF-κB p65、磷酸化 NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）、NF-κB 抑制蛋白 α(inhibitor of NF-κB α，IκBα）、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）、磷酸化 IκB 激酶 α（phospho-inhibitor of NF-κB kinase α，p-IKKα）、NLRP3抗体均购于Cell Signaling Technology公司（批号：3、16、10、18、19、9、3）；抗 Toll样受体 2（Tolllike receptor 2，TLR2）、抗 TLR4、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、抗含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）抗体均购于abcam公司（批号：GR3182784-1、GR308811-8、GR202191-1、2813878）。

1.1.3 主要仪器 Power Blotter XL半干转膜仪、HH-2细胞培养箱购于美国Thermo Fisher公司；Synergy H1型多功能微孔板检测仪、Mini-PROTEAN Tetra System垂直电泳仪购于美国BioTek公司；5427R型低温离心机购于德国Eppendorf公司；Odyssey Clx双色红外激光成像系统购于美国LICOR公司；数显恒温水浴锅购于常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药物的制备 土茯苓、黄柏、苍术、川牛膝购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，鉴定后按照本课题组方法自制，其中土茯苓：黄柏：苍术：川牛膝=3:3:2:1，提取物符合指纹图谱质控要求[11]。精密称取MSMP冻干粉1g，以10mL含10%体积分数二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的PBS超声溶解，浓度为100mg·mL-1，作为保存液，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，分装，-20℃避光保存。临用前以培养基稀释。

1.2.2 细胞培养 THP-1细胞采用含10%胎牛血清、0.05mmol·L-1β-巯基乙醇及 1%双抗的 RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，2～3d传代1次。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率 将THP-1细胞以5×104/mL的数量接种于96孔板中，每孔加入50ng·mL-1PMA，诱导24h使细胞贴壁，PBS洗涤后，在预试验的基础上，加入0.05～1.0mg·mL-1系列浓度的MSMP，分别作用12h或24h后弃去上清液，每孔加入200μL MTT溶液，培养4h后弃去，每孔加150μL DMSO，以空白孔调零，充分震荡，490nm处检测吸光度，计算各组细胞存活率。

1.2.4 实验分组与给药 将细胞分为空白组、模型组、秋水仙碱组和MSMP低、中、高剂量组。将THP-1细胞以5×105/mL的数量接种于6孔板中，每孔加入50ng·mL-1PMA，诱导24h使细胞贴壁，以PBS洗涤，除空白组外其余各组用1μg·mL-1LPS刺激24h，经PBS洗涤两次后，分别加入0.1μmol·L-1秋水仙碱和0.1、0.2、0.4mg·mL-1MSMP，然后分别加入 MSU，使终浓度为10mg·mL-1，刺激3h。收集各组细胞上清液或细胞裂解液，用于各项指标测定。

1.2.5 ELISA检测THP-1细胞培养上清液中IL-1β的水平 取细胞培养上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-1β水平。

1.2.6 Western blot检测相关蛋白表达 取细胞裂解液，BCA试剂盒进行蛋白定量。每泳道上样蛋白20μg，SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜，加入一抗，4℃封闭过夜，TBST洗涤3次，每次5min，加入二抗，孵育2h后，TBST洗涤3次，每次5min，以Odyssey Clx双色红外激光成像系统采集信息并摄取图像。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度MSMP对细胞存活率影响 实验结果显示MSMP对细胞存活率无明显影响，说明毒性较小、作用温和。给药处理24h后，MSMP剂量在0.05～0.4mg·mL-1时，细胞存活率均大于90%。见表1。因此以0.1、0.2、0.4 mg·mL-1作为后续实验中MSMP的剂量。

2.2 各组细胞培养上清液中IL-1β水平比较 与空白组比较，模型组IL-1β水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，MSMP低、中、高剂量组IL-1β水平均显著降低（P＜0.01），且具有剂量依赖性。见图1。

表1 不同浓度MSMP对细胞存活率的影响（±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of MSMP on cell viability(±s，%)

表1 不同浓度MSMP对细胞存活率的影响（±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of MSMP on cell viability(±s，%)

MSMP 浓度（mg·mL-1） 12h 24h 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0 100 99.72±0.23 99.73±0.27 97.60±0.13 97.41±0.05 96.46±0.12 94.71±0.03 100 93.12±0.06 93.31±0.12 93.14±0.07 92.88±0.03 86.42±0.11 80.38±0.09

图1 各组细胞培养上清液中IL-1β水平比较Fig.1 Comparison of level of IL-1β of culture supernatant in each group

2.3 各组细胞 MyD88、TLR2、TLR4蛋白表达比较与空白组比较，模型组MyD88、TLR2和TLR4蛋白表达量显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，MSMP中、高剂量组MyD88、TLR2和TLR4蛋白表达显著降低（P＜0.01）；MSMP 低剂量组 TLR2、TLR4的蛋白表达低于模型组（P＜0.05），MyD88蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。

图2 各组细胞MyD88、TLR2、TLR4蛋白表达比较Fig.2 Comparison of expression of MyD88,TLR2 and TLR4 protein in each group

2.4 各组细胞NF-κB炎症信号通路磷酸化蛋白表达比较 与空白组比较，模型组p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα 蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，MSMP 中、高剂量组 p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα 蛋白显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；MSMP 低剂量组p-NF-κB p65和p-IKKα蛋白表达降低（P＜0.01，P＜0.05），p-IκBα 蛋白表达无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.5 各组细胞NLRP3炎性体轴蛋白表达比较 与空白组比较，模型组NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，MSMP低、中、高剂量组NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达下降（P＜0.05，P＜0.01）。见图 4。

3 讨论

图3 各组细胞NF-κB炎症信号通路磷酸化蛋白表达比较Fig.3 Comparison of expression of phosphorylated proteins of NF-κB signaling pathway in each group

中医学认为痛风属“痹症”范畴，最主要的病因是“浊瘀痹”，即脾肾亏虚、湿浊、痰浊及瘀血，产生的代谢产物积聚于关节、软组织及软骨，从而引发体内一系列炎症反应[12]。因此，治疗痛风的关键在于清热祛湿、活血化瘀、疏通经络、调补脾肾等。根据中医治疗原则，本课题组研发了MSMP，方中土茯苓、黄柏为君，解毒除湿、通利关节；苍术为臣，燥湿健脾；川牛膝为使，逐瘀通经，全方符合中医治疗GA的治则。现代药理学研究也发现，土茯苓、黄柏等药物中黄酮类与生物碱类化合物具有良好的抗痛风、抗炎作用[13-16]。

图4 各组细胞NLRP3炎性体轴相关蛋白表达比较Fig.4 Comparison of expression of NLRP3 inflammasome axis protein in each group

GA发病过程中伴随着诸多信号通路的激活或抑制，其中NLRP3炎性体轴在许多急性和慢性炎症中处于中心地位[17]，MSU结晶被吞噬进入细胞时，细胞质中的NLRP3炎性复合体同时被激活。除上述激活途径外，内源性损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs） 也能促进 NLRP3炎性体、ASC与caspase-1前体相互作用，促使caspase-1前体从复合物中裂解，形成具有活性的caspase-1[18]。随后，活化的caspase-1促进IL-1β生成并释放到细胞外，IL-1β的异常分泌导致机体产生炎症反应，或者加重原有的炎症反应[19]。本研究发现，MSMP能明显下调NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达，降低IL-1β水平，这表明MSMP能通过下调NLRP3炎性体轴相关蛋白及caspase-1的表达，从而抑制IL-1β释放，防止GA急性发作。

研究表明，MSU作为DAMPs能够被细胞表面及细胞内的病原识别受体（如TLR2、TLR4等）识别，MyD88可为TLRs传递信号，在MSU诱导的免疫反应中，MyD88是必不可少的转接蛋白[20]。TLRs与病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）结合后，与MyD88的羧基末端相互作用，使MyD88活化。此外，在GA等炎症模型中，NF-κB对炎性因子的释放起到关键作用。当细胞处于静息状态时，NF-κB二聚体在细胞质中与IκBα结合而以无活性状态存在，受到刺激后，IκBα开始被IKKα磷酸化，而后迅速降解，释放活化的p-NF-κB，后者进入细胞核内与DNA结合，启动靶基因转录，刺激机体产生、释放白细胞介素-1β前体（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）[21-24]。本研究结果表明，在 THP-1 细胞中，MyD88活化后能够激活NF-κB，进而促进pro-IL-1β释放。MSMP能明显抑制IL-1β相关受体激酶的活化，从而下调TLR2、TLR4及NF-κB炎症信号通路相关蛋白的表达，减少pro-IL-1β释放，而且该机制与对NLRP3炎性体轴的抑制形成协同效应，进一步抑制IL-1β的产生，从而发挥抗GA的作用。

综上所述，本研究证实MSMP通过抑制NLRP3炎性体轴和NF-κB信号通路，从而协同抑制IL-1β等炎性因子释放，是其治疗GA的重要分子机制。