熊果酸通过AMPK介导的信号通路激活自噬改善油酸诱导的肝细胞脂肪沉积

冯璐燕 应娜 宋庆,2 窦晓兵,2

1.浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学分子医学研究所

3.浙江中医药大学第二临床医学院 4.浙江中医药大学基础医学院

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以肝脂质沉积为主要病理特征的慢性肝病，进一步可发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、甚至肝细胞癌[1]。据估计全球约有24%的成人患 NAFLD[2]，我国 NAFLD 患病率约为 15%～40%[3]。中医学认为，NAFLD的主要病因包括过于肥胖、情志失调、过食肥甘厚味、湿热毒邪侵入等，而久病体虚、气滞、食积和疫气等也与本病发生有关。有学者认为，本病的病机核心是痰瘀互结，蓄积于肝[4]。

熊果酸（ursolic acid，UA）是一种五环三萜类化合物，其广泛存在于苹果、蔓越莓、橄榄等多种植物中[5]，已成为人类饮食的重要组成部分。前期研究表明，UA能够改善高脂饮食诱导的NAFLD[6]，而其改善肝细胞内脂质沉积的机制目前尚未完全明确。因此，本研究以油酸（oleic acid，OA）诱导HepG2细胞建立肝细胞脂质沉积模型，探究UA对OA诱导的肝脂质沉积的影响及其分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂 人肝癌细胞（HepG2）购于美国培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。UA、OA、棕榈酸（palmitic acid，PA）、DMEM 培养基、氯喹（chloroquine，CQ）均购于 Sigma公司（批号：89797、75090、P5585、D5796、C6628）；雷帕霉素（rapamycin，Rap）购于 selleck 公司（批号：S1039）；Bodipy 493/503染液购于 Invitrogen公司（批号：D2191）；胎牛血清购于Biological industries公司（批号：04-001-1ACS）；抗微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phospho-AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、抗腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗体均购于 Cell Signaling Technology 公司（批号：#2772、#2535、#2532）；甘油三酯（triglyceride，TG）检测试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司（批号：E1003）；BCA蛋白浓度检测试剂盒购于碧云天生物技术公司（批号：P0010）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗 IgG购于Boster公司（批号：BA1054）。

1.2 主要仪器和设备 酶标仪为美国MD公司产品；数字凝胶成像系统购于美国Protein Simple公司，荧光显微镜购自Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，放置在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液，待细胞融合至80%～90%时进行传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.2 细胞干预 取对数生长期细胞，以105个/mL的数量接种于24孔板内，每孔体积1mL，置于培养箱中培养24h后，设未加药物的细胞为对照组，其余组别细胞分别予 0.25、0.5、0.75mmol·L-1的 OA 和0.25、0.5、0.75mmol·L-1的 PA 干预 16h，检测肝细胞内脂质沉积情况；再分别以 0、10、20、40μmol·L-1的UA干预细胞16h后检测相关蛋白表达水平。采用1μmol·L-1自噬激动剂 Rap 及 20μmol·L-1自噬抑制剂CQ预处理细胞1h后给予OA干预16h，检测肝细胞内脂质沉积情况；采用1μmol·L-1自噬激动剂Rap及20μmol·L-1自噬抑制剂CQ预处理细胞1h后，再加入UA干预2h，随后给予OA处理16h，检测肝细胞内脂质沉积情况。

1.3.3 脂质沉积检测 通过测定细胞内TG含量和脂质染色检测细胞内脂质沉积。分别采用TG检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒，测定细胞内TG和蛋白质的含量，并依据蛋白质含量对TG含量进行校正。脂质染色采用Bodipy法，2μmol·L-1Bodipy于37℃染色30min，荧光显微镜下检测。

1.3.4 Western blot检测 LC3B、p-AMPK、AMPK 蛋白表达 收集细胞，以PBS漂洗后，加入适量蛋白裂解液，冰上裂解30min，充分涡旋震荡后，于4℃下12 000r/min离心15min，收集上清液，以BCA法测定蛋白浓度，蛋白定量后10%SDS-PAGE电泳分离，低温转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST液室温封闭 1h，加入相应的一抗（LC3B、p-AMPK、AMPK），4℃孵育过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，每次10min，再加入山羊抗兔二抗IgG，室温摇床孵育1h，回收二抗，TBST洗膜3次，每次10min，化学发光法成像，采用数字凝胶成像仪对图像进行拍照分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，先进行方差齐性检验，满足方差齐性时组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同脂肪酸对肝细胞脂质沉积的影响 分别采用不同浓度的OA和PA干预后，与对照组比较，OA和PA均呈剂量依赖关系显著增加肝细胞内TG含量（P＜0.05，P＜0.01）。见图 1A。Bodipy染色观察发现，OA和PA诱导的脂质沉积结果与TG检测结论一致。见图1B。随着OA和PA的浓度增加，胞内脂滴含量显著增加，且OA诱导的肝脂质沉积效果明显高于相同浓度的PA，因此后续实验中采用0.5mmol·L-1OA作为干预因素。

图1 不同脂肪酸对HepG2细胞脂质沉积的影响Fig.1 Effect of different fatty acids on lipid deposition of HepG2 cells

2.2 各组细胞脂质沉积比较 采用不同浓度UA预处理细胞后，再予0.5mmol·L-1OA干预，结果显示，与对照组比较，OA组TG含量增加明显（P＜0.01）；与OA 组比较，UA 20、40μmol·L-1组 TG 含量减少（P＜0.05，P＜0.01），随着剂量加大，TG含量减少更明显。见图2A。同时用Bodipy染色进行观察，提示UA以剂量依赖关系显著改善OA所诱导的脂滴堆积，但与对照组比较，最大剂量（40μmol·L-1）UA 本身对细胞内脂质沉积无明显影响。见图2B。

图2 各组细胞脂质沉积比较Fig.2 Comparison of lipid deposition in each group

2.3 自噬调控OA诱导的肝细胞脂质沉积 分别采用自噬激动剂Rap和自噬抑制剂CQ进行预处理，检测自噬对OA诱导的脂质沉积的影响。结果表明抑制自噬可显著加重OA诱导的脂质沉积，而激活自噬能显著改善脂质沉积情况（P＜0.05）。见图3A。通过Bodioy染色观察得到一致的结论，与OA组比较，CQ预处理后细胞内脂滴含量增加，Rap预处理后细胞内脂滴含量显著降低。见图3B。

图3 自噬调控OA诱导的肝细胞脂质沉积Fig.3 Autophagy modulates OA-induced lipid deposition in hepatocytes

2.4 抑制自噬对UA脂质沉积保护作用的影响 给予不同浓度UA作用后，Western blot结果表明UA能以剂量依赖关系激活LC3BⅡ的表达（P＜0.05，P＜0.01）。见图4A。以20μmol·L-1自噬抑制剂CQ预处理1h后再予40μmol·L-1UA处理2h，随后添加OA处理16h，检测细胞内TG含量，研究结果表明抑制自噬可显著阻断UA的保护作用（P＜0.05）。见图4B。Bodipy染色观察结果也得到一致结论。见图4C。提示自噬信号通路参与了UA抑制OA诱导的脂质沉积。

2.5 UA激活AMPK磷酸化 UA预处理HepG2肝细胞后，Western blot检测提示UA能显著提高AMPK蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

本研究发现，UA可显著改善OA诱导的肝细胞脂质沉积。机制研究表明UA可显著激活肝细胞自噬，而抑制自噬可显著阻断UA所起到的保护作用，说明UA通过激活自噬发挥抑制肝脂质沉积的作用。此外，UA可显著提高自噬调控的上游靶点AMPK的磷酸化水平，提示AMPK可能参与UA激活的自噬。

我国历代医学典籍都记载着古代医家对“肝着”“肝癖”“积聚”等论述，其病因病机及治则治法与现代医学NAFLD十分相似。NAFLD其病位主要在于肝，最早相关记载见于《难经》：“肝之积名曰肥气……”[7]提示其与过食肥甘厚味有关；丹波元坚[8]所著《杂病广要》中也有“肝气被压……横行之则两胁痛”之说，认为偏嗜肥甘厚腻也会导致NAFLD发病。由此可知，脂质是由津液、水谷所化生的精微物质，是人体新陈代谢不可或缺的，然而其过剩的部分亦对机体造成损害。近代医家认为NAFLD的病机主要为肝失疏泄、肝血瘀滞等，病理基础与肝脏功能关系密切[9]。前期研究显示，UA能够改善高脂饮食诱导的NAFLD[6]，但是对UA影响脂质沉积机制并不清楚，因此本研究通过建立脂质沉积模型，探究UA改善肝细胞脂质沉积的作用机制。

图4 抑制自噬对UA脂质沉积保护作用的影响Fig.4 Effect of inhibition of autophagy on protective effect of UA on lipid deposition

图5 UA通过激活AMPK磷酸化激活自噬Fig.5 UA activates autophages by activation of AMPK phosphorylation

为探究UA对肝细胞脂质沉积的影响，本研究分别使用OA和PA对HepG2细胞进行干预，结果表明随着OA和PA的浓度升高，HepG2细胞内TG含量增加，两种脂肪酸均能促进肝细胞内脂质沉积，而与PA比较，相同浓度的OA诱导脂质沉积更为显著，这与先前研究报道一致[10]，因此本研究使用OA建立脂质沉积模型进行后续研究。为了验证UA是否对OA诱导的脂质沉积起到保护作用，在OA干预前给予不同剂量的UA预处理HepG2细胞2h，细胞内TG含量测定及Bodipy荧光染色的结果表明，UA能够显著降低OA诱导的脂质沉积，其作用呈剂量依赖关系。

现有研究表明，自噬在NAFLD的发展和发病过程中起着至关重要的作用，激活自噬可通过消除过度的肝脏脂滴和线粒体受损（分别称为脂噬和有丝分裂），调节肥胖相关的NAFLD患者的脂质代谢[11-12]。本研究中使用自噬激动剂Rap及自噬抑制剂CQ分别对HepG2细胞进行预处理，提示自噬激动剂Rap能有效减轻OA诱导的肝细胞脂质沉积，而自噬抑制剂则会加重脂质沉积的现象，这与目前研究一致[13]。前期研究中已证实，UA能够通过自噬改善脂毒性诱导的肝细胞死亡[14]，因此进一步对UA是否能够通过自噬减轻肝细胞脂质沉积进行验证。结果表明，使用自噬抑制剂CQ进行预处理后，UA对OA诱导的脂质沉积的改善作用受到抑制，该结果进一步提示UA能够通过激活自噬改善OA诱导的脂质沉积。

本研究进一步对UA激活自噬的机制进行了探究。目前研究表明，参与自噬调节的机制是多因素的[15]。而AMPK已被公认为自噬的正调节者[16]，可作为细胞存活或死亡的关键调节因子，参与各种病理应激反应，包括氧化应激、内质网应激、缺氧和渗透应激等[17]。此外，它具有促分解代谢功能，是细胞脂质代谢的主要调节剂，一旦被激活，AMPK能够降低脂质合成和相关过程中必需酶的活性。因此，本研究通过Western blot检测UA是否能够激活AMPK，结果显示，UA能够提高AMPK的磷酸化水平。该结果提示UA激活自噬可能与促进AMPK磷酸化有关，表明UA可能通过AMPK调控自噬从而改善OA诱导的肝细胞脂质沉积。

综上所述，本研究发现UA可能通过调控AMPK的磷酸化进一步激活自噬，从而抑制OA诱导的肝细胞脂质沉积，该结果提示UA可作为防治NFALD的潜在药物。