红景天苷通过调节miR-30d-5p表达减弱大鼠心肌细胞肥大的机制研究

余平

1.浙江省立同德医院 杭州 310012 2.浙江中医药大学药学院

心力衰竭的前期通常伴随着心脏肥大的过程，心肌肥厚和心室容量减少是心脏肥大的两个主要标志，左心室心肌肥厚往往继发于高血压引起的心脏负荷增加，患者最终可发生心力衰竭[1]。近年来，心力衰竭发病率和死亡率升高的趋势日益明显，提高该病的防治水平势在必行。相对于化学药物不良反应大的弊端，天然药物治疗心力衰竭往往从抗氧化、改善微循环、扩张冠脉、增加血流量等多方面同时发挥作用[2-3]，在治疗心力衰竭方面具有广阔的应用前景。

红景天是一种传统中药，临床上广泛用于治疗包括心力衰竭在内的多种心血管疾病。红景天苷（salidroside，SAL）是红景天最有效的活性成分之一，临床上广泛用于各种疾病的治疗[4]。SAL作用机制多样，能够通过增加蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）的磷酸化，降低半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）的活化来抑制心肌细胞凋亡[5]；还能够通过增加缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达水平，减轻缺氧诱导的心肌细胞坏死和凋亡，并通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt通路，减轻心肌缺血再灌注损伤[6-7]；SAL能够通过调节过氧化物酶增殖物活化受体γ辅助活化因子-1α（peroxisome proliferators-activiated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）-核呼吸因子 1（nuclear respiratory factor1，NRF1）/核呼吸因子 2（nuclear respiratory factor2，NRF2）通路改善心肌线粒体呼吸功能，并通过增加细胞质中VEGF和CD34的mRNA和蛋白水平来促进心肌损伤后的血管生成[8-9]。

微小RNA（microRNA，miR）是一类内源性小RNA分子，能够通过抑制翻译或引发mRNA靶标的降解来抑制蛋白质合成[10]。研究已证实，miR与心肌肥厚和心力衰竭的病理过程相关[11]。课题组前期筛选出了一系列改善心肌肥厚的中药单体，其中就包括SAL。然而，SAL是否可以通过调节心肌细胞的miR表达，改善心肌肥厚仍不清楚。本研究拟观察SAL对大鼠肥大心肌细胞中的miR表达的影响，并进一步研究对下游基因的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 Trizol、lipofectamine2000均购于Invitrogen 公司（批号：20171115、20171210）；双荧光素酶psiCheck2报告质粒购于Promega公司（批号：0009015）；双荧光素酶报告基因测定试剂盒、逆转录试剂盒均购于Thermo Fisher公司（批号：00501250、00300820）；全蛋白提取试剂盒购于Keygen公司（批号：T025413）；BCA 蛋白定量试剂盒、D-Hanks液均购于 Solarbio公司（批号：B8733、D5127）；miScript ⅡRT Kit购于 QIAGEN 公司（批号：216415）；miRcute miRNA qPCR Detection Kit购于SYBR Green公司（批号：20170110）；iScript cDNA synthesis kit购于BIO-RAD 公司（批号：1708890）；5-溴-2-脱氧尿苷（5-Bromouracil deoxyriboside，BrdU）、苯肾上腺素（phenylephrine，PE）、抗 actin抗体均购于 Sigma公司（批号：201181、202527、301137）；抗葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78，GRP78）抗体、抗三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购于Abcam公司（批号：3495-1、2887-1）；免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Alexa Fluor 647为碧云天公司产品（批号：P0191）；红景天苷购于北京世纪奥科生物科技有限公司（纯度≥98%，分子式：C14H2O7，分子量：300.3，批号：160920）。

1.2 仪器 低温离心机购于Eppendorf公司；定量PCR仪7900 HT Sequence Detection System为ABI公司产品；FV1000激光共聚焦显微镜为Olympus公司产品；凝胶成像系统购于BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌肥大细胞模型建立 1～3日龄SD大鼠由浙江中医药大学实验动物中心提供。在37℃培养箱中以0.2%胰蛋白酶消化分离的新生大鼠心室肌细胞，离心后，以（3～5）×105的细胞密度培养于含有20%胎牛血清的DMEM培养基中。接种24h后除去血清，以100μmol·L-1PE诱导细胞。将心肌肥大细胞模型随机分为两组：SAL组和模型组，SAL组以10μL·mL-1SAL处理48h，另外将正常原代培养的大鼠心肌细胞作为正常对照组。

1.3.2 心肌细胞免疫荧光染色和细胞表面积分析取无菌盖玻片置于24孔板内，将心肌细胞接种于盖玻片上，在4%多聚甲醛中固定15min，以含0.1%Triton X-100的PBS透化，含5%PBS的脱脂奶粉封闭1h，再加入1:500稀释后的actin抗体温育过夜并以PBS洗涤3次，与二抗共孵育，PBS洗涤后安装载玻片，激光共聚焦显微镜下拍摄图像，以AxioVision 4.7.1（Carl Zeiss）软件分析细胞表面积。

1.3.3 miR微阵列分析 miR微阵列实验和分析由上海伯豪生物技术有限公司完成。使用Trizol试剂提取3组心肌细胞总RNA，每组设有3个复孔，通过miR微阵列（Chip ID miRRat 11.0 version，LC Sciences，Houston，TX，USA）进行分析。减去背景分析数据，使用LOWESS滤波器将信号标准化为局部回归加权。使用3个生物学重复的平均值作为miR的表达水平，并通过Student's t检验进行3组间的比较。

1.3.4 miR靶基因预测 经基因芯片筛选出模型组和SAL组中表达差异的miR，在符合要求的两种miR中，miR-30d-5p表达差异度高于miR-199a-5p，因此选择miR-30d-5p作为研究对象。数据库网址：TargetScan（http://www.targetscan.org），MiRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）和 MirWalk（http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk）。

1.3.5 荧光素酶报告质粒的构建及荧光素酶活性分析 通过NCBI网站查获miR的基因组序列，Primer 3设计含Xho1和Not1酶切位点的PCR引物，左侧Xho1 引物：5'-ctcgagCGGAGCAGAGCCATGGGCACGTCTTCAG-3'，右侧 Not1 引物：5'-gcggccgcCCTATTGCTGGATGCTTTCCAAGTCCC-3'。按以下反应体系扩增 miR前体：2×Ex Taq 5μL、左侧引物0.2μL、右侧引物 0.2μL、DNA 3μL，ddH2O 1.6μL；反应条件如下：95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，共 25 个循环。用Xho1和Not1消化PCR产物，长度为387bp，对含有miR-30d-5p结合位点的GRP78 3’-UTR片段进行PCR扩增，引物序列：上游引物5'-GGAGTGGGTCAATTCTGTTGTCA-3'；下游引物5'-CCCGGCACTAACGTCATTC-3'。通过Real-time PCR扩增GRP78-3'UTR片段，并与psiCheck2质粒-Report连接，以构建psiCheck2质粒GRP78 3'-UTR荧光素酶报告基因载体。以合成萤火虫荧光素酶基因作为转染对照，lipofectamine2000转染，用含有GRP78 3'-UTR miRNA转染的psiCheck2载体共转染293T细胞，孵育24h后在发光计上检测荧光素酶活性，以阴性对照RNA作为对照。

1.3.6 Real-time PCR检测miR-30d-5p和GRP78 mRNA水平 心肌细胞总RNA的提取同前。miR-30d-5p引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACG-AACAG-3’。GRP78引物序列：上游引物5'-GGAGTGGGTCAATTCTGTTGTCA-3’；下游引物5'-CCCGGCACTAACGTCATTC-3’。逆转录反应条件 25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min；PCR过程按qPCR试剂盒说明书在荧光定量PCR仪上进行。PCR反应条件：95℃5min，95℃ 10s，60℃ 30s，共40个循环。以GAPDH为内参照，获得Ct值后，应用比较Ct法进行相对定量，目标基因的相对表达量按2-ΔΔCt计算。

1.3.7 心肌细胞转染 细胞培养同1.3.1。lipofectamine 2000转染，按照指示miR最终浓度为400ng/孔。转染24h后，将原始培养基替换为不含血清的DMEM培养基。将细胞分为6组：阴性对照组（转染阴性对照RNA的正常心肌细胞）、PE+阴性对照组（转染阴性对照RNA的PE诱导后心肌细胞）、miR-30d-5p模拟物组（转染miR-30d-5p模拟物的PE诱导后心肌细胞）、miR-30d-5p抑制物组（转染miR-30d-5p抑制物的PE诱导后心肌细胞）、miR-30d-5p模拟物+SAL组（转染miR-30d-5p模拟物的PE诱导后心肌细胞，并以SAL 10μL·mL-1处理）和miR-30d-5p抑制物+SAL组（转染miR-30d-5p抑制物的PE诱导后心肌细胞，并以SAL 10μL·mL-1处理）。转染24h后，更换培养基，继续以含有新鲜胎牛血清的培养基培养48h。

1.3.8 Western blot检测蛋白表达 以蛋白提取试剂盒提取各组心肌细胞总蛋白，测定总蛋白浓度后，加入上样缓冲液煮沸3min变性，经SDS/PAGE电泳，转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭后分别与1:1 000稀释的一抗（抗GRP78抗体和抗GAPDH）4℃孵育过夜，与1:5 000稀释的相应二抗在室温下孵育2h，ECL化学发光，凝胶成像系统拍照，对结果进行灰度扫描分析。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。所有计量资料均采用±s表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞表面积比较 心肌细胞免疫荧光染色结果显示，PE处理后心肌细胞发生肥大，与正常对照组比较，模型组细胞表面积增大约31%（P＜0.01）；与模型组比较，SAL组心肌细胞表面积减小约15.3%（P＜0.01）。见图 1。

2.2 microRNA微阵列分析 与正常对照组比较，模型组中14种miR表达差异明显，其中5种上调、9种下调；与模型组比较，SAL组中10种miR表达差异明显，其中7种上调、3种下调。模型组miR-30d-5p表达量显著低于正常对照组和SAL组（P＜0.01），而SAL组miR-30d-5p表达量与正常对照组无统计学差异（P＞0.05）。见图 2。说明 miR-30d-5p下调可能是导致心肌肥大的机制之一，而SAL能够抑制miR-30d-5p下调。

图1 心肌细胞免疫荧光染色结果Fig.1 Myocardial immunofluorescence staining results

图2 miR微阵列分析结果Fig.2 MiR microarray analysis results

2.3 生物信息学方法和双荧光素酶报告基因测定结果 生物信息学方法确定miR-30d-5p的潜在靶基因为GRP78，在GRP78 mRNA的3'-UTR中进行miR-30d-5p一个结合位点的鉴定，见图3A。PE诱导后，与正常对照组比较，模型组中miR-30d-5p水平降低 0.4倍（P＜0.05）；与模型组比较，SAL组中 miR-30d-5p表达增加了0.4倍（P＜0.05）。见图3B。Realtime PCR检测发现，与正常对照组比较，模型组GRP78 mRNA 表达显著增加 （P＜0.05）；SAL 组GRP78 mRNA 表达低于模型组（P＜0.05），但与正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3C。采用双荧光素酶报告基因测定验证miR-30d-5p和GRP78之间的关系，提示与阴性对照组比较，与GRP78 3'-UTR融合的荧光素酶报告基因表达被miR-30d-5p模拟物抑制了31%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3D。证实 miR-30d-5p通过其 3'抑制GRP78表达。Western blot结果也显示，miR-30d-5p组GRP78表达下调，而抗miR-30d-5p组GRP78表达上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3E、3F。上述结果表明，miR-30d-5p可直接靶向调节GRP78的表达。

图3 生物信息学方法和双荧光素酶报告基因测定结果Fig.3 Results of bioinformatics method and dual luciferase reporter gene assay

与阴性对照组比较，转染miR-30d-5p模拟物后miR-30d-5p的表达水平显著增加（P＜0.01）。见图4A。Real-time PCR分析结果显示，与阴性对照组比较，分别用miR-30d-5p模拟物或miR-30d-5p抑制物转染48h后，再用10μL·mL-1的SAL处理心肌细胞，miR-30d-5p的表达水平分别增加3.3倍和3.14倍（P＜0.01）。见图4B。GRP78 mRNA水平分别下调了 55%和 53%（P＜0.01）。见图 4C。

图4 miR-30d-5p模拟物或miR-30d-5p抑制物转染48h结果Fig.4 Results of miR-30d-5p mimics or miR-30d-5p inhibitor transfection for 48h

2.4 各组GRP78蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型组GRP78蛋白表达显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，SAL组GRP78蛋白表达显著降低（P＜0.01），SAL和正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5A、B。心肌肥大细胞模型经miR-30d-5p模拟物转染后，GRP78蛋白表达显著下降（P＜0.01）；经miR-30d-5p抑制物转染后，GRP78蛋白表达显著增加（P＜0.01）。SAL处理后，与PE+阴性对照组比较，GRP78蛋白表达显著降低（P＜0.01）。见图 5C、D。

3 讨论

SAL是中药红景天最有效的活性成分之一，化学名为对羟基苯乙基-β-D葡萄糖苷，其苷元为对羟基苯乙醇。SAL主要来源于红景天属、越桔属、杜鹃花属、女贞属等多种植物，为无色透明针状结晶[12]。研究证实，SAL具有心脏保护、抗疲劳、抗压力、抗抑郁、抗焦虑、提高神经功能及兴奋中枢神经系统等多种功效[13]。

miR是长度为20～24个核苷酸的非编码RNA家族[11]。本实验首次从miR的角度系统性研究了SAL在调节心肌细胞肥大中的作用机制。结果表明，PE诱导的心肌细胞肥大与两类不同的miR改变有关，这两类miR对心肌细胞具有相反的表型效应。本研究的结果为SAL调节肥大心肌细胞中的miR表达提供了明确证据。其中，最显著的变化是模型组中的miR-30d-5p表达下调，而SAL可以抑制这种下调。通过生物信息学算法、双荧光素酶报告基因检测和Real-time PCR鉴定明确miR-30d-5p的靶基因为GRP78。

图5 各组GRP78蛋白表达比较Fig.5 Comparison of the expression of GRP78 protein in each group

心脏是一种高度塑化的器官，随着生理或病理需求的变化而扩大或收缩。当心室肥大时，心脏会扩张，收缩功能下降，因而导致心衰[14]。心脏肥大是心肌细胞对各种刺激的补偿反应，主要病理变化是心肌细胞体积增大和心肌细胞蛋白质合成增加[15-16]。GRP78又称免疫球蛋白重链结合蛋白（immuno-globulin heavy chain binding protein，Bip），属于热休克蛋白 70 家族的一员，是内质网上重要的分子伴侣[17]。GRP78分子及其DNA序列结构在许多生物物种中高度保守[18]。GRP78参与阻止内质网新生肽聚集、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡，以及启动未折叠蛋白反应等细胞生命过程[19]。既往研究证实，GRP78参与的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）过程与心肌肥大相关[20-21]。本研究结果提示，模型组中GRP78的蛋白表达显著增加，GRP78是miR-30d-5p的靶基因，miR-30d-5p上调可以抑制心肌细胞中GRP78 mRNA和蛋白质的表达，miR-30d-5p下调则可以促进GRP78的表达，提示GRP78介导的ERS信号低表达可能是心肌细胞肥大的原因，而SAL可以逆转这一过程。

综上所述，本研究初步证实miR-30d-5p具有抑制心肌肥大的作用，SAL可能通过增加心肌细胞中miR-30d-5p的表达，降低GRP78 mRNA及蛋白表达，从而改善心肌肥大。该研究结果有助于更好地了解SAL在心肌细胞肥大治疗中的潜在机制。