银杏叶正丁醇部位化学成分及其抗氧化活性研究

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

银杏（Ginkgo biloba L.）作为银杏科唯一幸存的物种，有“活化石”之称，已被国际自然保护联盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）红色名录[1]和《中国植物红皮书》[2]列为濒危植物。现代药理学研究认为，银杏提取物具有广泛的生物活性，包括清除自由基、改善血液流变学指标、保护血管、增强认知能力、抗血小板活化等[3]。银杏叶为我国特色中药材，近几年来引起了国内外学者的广泛关注。银杏叶化学成分复杂、种类繁多，目前绝大部分研究集中于对黄酮类和萜内酯类活性成分的研究，这两类成分主要分布于银杏叶的石油醚和乙酸乙酯部位，而对于其正丁醇部位的化学及药理研究较少，故本实验对银杏叶正丁醇部位进行系统研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品试剂和主要消耗品 银杏叶购于云南希康生物科技有限公司（批号：20160702）；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、维生素 C（vitamin C，Vit C）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）均购于上海源叶生物科技有限公司 （批号：W27F10E81251、J04A10R84808、25D8N51258、Y27A10K87055）；过硫酸钾购于上海展云化工有限公司（批号：190103）；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购于美国TEDIA公司（批号：19015156、19055131）；纯净水购于杭州娃哈哈集团有限公司（批号：20190220）；其余试剂均为分析纯。柱色谱硅胶（100～200目、200～300目）和薄层色谱硅胶 GF254购于青岛海洋化工有限公司（批号：0180026、0180192、20180318）；聚酰胺（60～90目）购于江苏长丰化工有限公司（批号：20181115）；XB-C18填料购于禹城化工（上海）有限公司（批号：401M014）。

1.1.2 主要仪器 BioTek Cytation 1细胞成像多功能酶标仪购于美国BioTek公司；Bruker AVANCEⅢ600MHz核磁共振仪购于瑞士 Bruker公司；SHIMADZU LC-MS 8050液质联用仪购于日本岛津公司；Agilent 1260高效液相色谱和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）均购于美国安捷伦公司；岛津LC-20A半制备液相色谱仪、Shim-pack GIST色谱柱（20mm×250mm，5μm）均购于日本岛津公司；旋转蒸发仪购于瑞士Buchi公司；冷冻干燥机购于上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取和分离 将10kg干燥银杏叶粉碎，分别用10倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次1h，合并所有提取液，减压浓缩干燥，得到银杏叶醇提总浸膏3.5kg。银杏叶总浸膏用水均匀混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分级萃取，萃取液减压浓缩，分别得到石油醚部位385g、乙酸乙酯部位388g、正丁醇部位600g。取正丁醇部位300g经聚酰胺色谱柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱，经分析合并得到5个馏分Fr.A1～A5。Fr.A1（3.6g）以二氯甲烷-甲醇（1:0-0:1）为洗脱溶剂，经硅胶色谱柱，分离得到8个馏分 Fr.B1～B8。Fr.B2（211mg）经半制备液相甲醇-水（3:7）纯化，得到化合物1（28.1mg）。Fr.A3（21g）以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1）为洗脱溶剂，经硅胶色谱柱，分离得到9个馏分Fr.C1～C9。Fr.C8（3.4g）经反相十八烷基硅烷键合硅胶（octade-cylsilyl，ODS）色谱柱处理后得到流分 Fr.C8.a～Fr.C8.h。Fr.C8.b（1.7g）经开放ODS柱色谱处理和半制备液相分离纯化后得到化合物2（41mg）和化合物3（8.4mg）。Fr.C8.d（32mg）、Fr.C8.e（59mg）、Fr.C8.g（17mg）分别经半制备液相分离纯化得到化合物4（15.8mg）、化合物 5（19.8mg）和化合物 6（4.8mg）。化合物 1～6 结构见图1。

1.2.2 抗氧化活性测定 化合物抗氧化活性分别采用1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法和 2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)自由基清除法测定。

1.2.2.1 DPPH自由基清除法 用无水乙醇将DPPH配制成 2×10-3mol·L-1溶液，4℃避光保存。将 Vit C 和Trolox分别用纯净水和无水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，化合物3～6分别用无水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，化合物1、2分别用无水乙醇配制成4×10-3mol·L-1溶液，使用前以纯净水或无水乙醇稀释成所需浓度。

参考段世廉等[4]的方法并加以改进，将不同浓度的供试品溶液 60μL和 1×10-4mol·L-1DPPH 溶液140μL加入96孔板各孔中，选择常用抗氧化剂Vit C和Trolox作为阳性对照，同时以不加DPPH（以140μL无水乙醇代替DPPH）的各浓度供试品溶液作为对照，以消除供试品本身颜色对测定结果的干扰，并设DPPH空白对照（以60μL无水乙醇代替供试品），每组平行设置3个复孔。将96孔板放入酶标仪中，振荡1min，室温避光保存15min后测定其在517nm处的吸光度A，按如下公式计算供试品的自由基清除率。

其中AS为各浓度供试品吸光度的平均值；AC为供试品本身的吸收本底；A0为DPPH空白对照吸光度的平均值。采用SPSS 20.0统计软件计算半数清除率（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.2.2 ABTS自由基清除法 用纯净水将ABTS和过硫酸钾分别配制成 7×10-3mol·L-1和 2.45×10-3mol·L-1的溶液，等体积混合后，室温避光条件下静置12～16h。测定前，将上述混合液用纯净水稀释20倍，使其在734nm下的吸光度为0.7±0.02，制得ABTS工作液，备用。将Trolox用无水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，化合物2用无水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，其余化合物分别用无水乙醇配制成4×10-3mol·L-1溶液，使用前用无水乙醇稀释至所需浓度。

参考乐世俊等[5]的方法并加以改进，将不同浓度的供试品溶液60μL和ABTS工作液140μL加入96孔板各孔中，以Trolox作为阳性对照，同时设ABTS空白对照（以60μL无水乙醇代替供试品），每组平行设置3个复孔。将96孔板放入酶标仪中，振荡1min，室温避光保存90min后测定其在734nm处的吸光度A，按如下公式计算供试品的自由基清除率。

其中AS为各浓度供试品吸光度的平均值；A0为ABTS空白对照吸光度的平均值。采用SPSS 20.0统计软件计算IC50。

图1 化合物1～6化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1～6

2 结果

2.1 结构鉴定

2.1.1 化合物1 为黄色油状物。电喷雾电离-质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）m/z:127.06[M+H]+，分子式为 C6H6O3。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:9.53(1H,s,CHO)，7.38(1H,d,J=2.4Hz,H-3)，6.58(1H,d,J=2.3Hz,H-3)，4.60(2H,s,CH2OH);13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:179.4(CHO)，163.2(C-5)，153.9(C-2)，124.8(C-3)，110.9(C-4)，57.6(CH2OH)。光谱数据与文献[6]报道的基本一致，故确定该化合物为5-羟甲基糠醛。

2.1.2 化合物2 为黄色无定形粉末。ESI-MS m/z:617.15[M+Na]+，分子式为C27H31O15。1H-NMR(600MHz,CD3SOCD3)δ:12.53(1H,S,OH)，7.76(2H,d,J=8.7Hz,H-2′,6′)，6.91(2H,d,J=8.7Hz,H-3′,5′)，6.39(1H,d,J=1.8Hz,H-8)，6.19(1H,d,J=1.8Hz,H-6)，5.56(1H,s,H-1′′)，4.24(2H,d,J=7.8Hz,H-1′′′)，4.08(2H,d,J=2.4Hz,H-2′′)，0.86(3H,d,J=6.1Hz,H-6′′)；13C-NMR(150MHz,CD3SOCD3)δ:177.6(C-4)，164.8(C-7)，161.3(C-5)，160.1(C-4′)，157.0(C-2)，156.6(C-9)，134.5(C-3)，130.6(C-2′,6′)，120.4(C-1′)，115.4(C-3′,5′)，106.1(C-1′′′)，104.0(C-10)，100.9(C-1′′)，98.9(C-6)，93.8(C-8)，81.3(C-2′′),76.7(C-3′′′)，76.3(C-5′′′)，73.9(C-2′′′)，71.7(C-4′′)，70.4(C-5′′)，70.2(C-3′′)，69.3(C-4′′′)，60.5(C-6′′′)，17.4(C-6′′)。光谱数据与文献[7]报道的基本一致，故确定该化合物为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷。

2.1.3 化合物3 为黄色无定形粉末。ESI-MS m/z:617.15[M+Na]+，分子式为 C27H31O15。1H-NMR(600MHz,CD3SOCD3)δ:12.52(1H,s,OH)，7.97(2H,d,J=8.8Hz,H-2′,6′)，6.87(2H,d,J=8.8Hz,H-3′,5′)，6.36(1H,d,J=1.8Hz,H-8)，6.16(1H,d,J=1.8Hz,H-6)，5.29(1H,d,J=7.6Hz,H-1′′)，4.38(1H,d,J=1.2Hz,H-1′′′)，0.98(3H,d,J=6.2Hz,H-6′′′)；13C-NMR(150MHz,CD3SOCD3)δ:177.2(C-4)，163.9(C-7)，161.1(C-5)，159.9(C-4′)，156.6(C-2)，156.6(C-9)，133.2(C-3)，130.9(C-2′)，130.8(C-6′)，120.9(C-1′)，115.1(C-3′,5′)，103.7(C-10)，100.8(C-1′′)，100.8(C-1′′′)，98.8(C-6)，93.9(C-8)，76.4(C-3′′)，75.7(C-5′′)，74.2(C-2′′)，71.8(C-4′′′)，70.6(C-3′′′)，70.4(C-2′′′)，69.9(C-4′′)，68.3(C-5′′′)，66.9(C-6′′)，17.7(C-6′′′)。光谱数据与文献[8]报道的基本一致，故确定该化合物为山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷。

2.1.4 化合物4 为无色油状物。ESI-MS m/z:279.15[M+H]+，分子式为 C16H22O4。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.71(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-3,6)，7.61(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-4,5)，4.28(4H,t,J=6.6Hz,H-8,8′)，1.71(4H,m,H-9,9′)，1.45(4H,m,H-10,10′)，0.97(6H,t,J=7.4Hz,11,11′-CH3)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:169.3(C-7,7′)，133.6(C-1,2)，132.3(C-4,5)，129.9(C-3,6)，66.6(C-8,8′)，31.7(C-9,9′)，20.2(C-10,10′)，14.0(C-11,11′)。光谱数据与文献[9]报道的基本一致，故确定该化合物为邻苯二甲酸二丁酯。

2.1.5 化合物5 为白色无定形粉末。ESI-MS m/z:699.40[M+Na]+，分子式为 C33H56O14。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:5.37-5.29(6H,m,H-9,10,12,13,15,16)，4.23(1H,d,J=7.4Hz,H-1′′)，4.13(1H,d,J=4.4Hz,H-1′′′)，3.97(1H,m,H-2′)，2.79(4H,t,J=6.0Hz,H2-11,14)，2.34(2H,t,J=7.5Hz,H2-2)，2.06(4H,m,H2-8,17)，1.38-1.30(10H,m,H2-3,4,5,6,7)，0.96(3H,t,J=7.5Hz,H3-18)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:175.5(C-1)，132.7,131.1,129.2,129.2,128.8,128.2(C-9,10,12,13,15,16)，105.3(C-1′′)，100.5(C-1′′′)，74.6(C-3′′)，74.5(C-5′′)，72.5(C-2′′)，72.5(C-5′′′)，72.1(C-1′)，71.4(C-3′′′)，71.0(C-4′′′)，70.2(C-2′′′)，70.1(C-4′′)，69.6(C-2′)，67.7(C-6′′)，66.6(C-3′)，62.7(C-6′′′)，34.9(C-2)，30.7,30.3,30.2,30.2,28.2,26.5,26.4,26.0(C-4,5,6,7,8,11,14,17)，21.5(C-3)，14.7(C-18)。光谱数据与文献[10]报道的基本一致，故确定该化合物为姜糖脂A。

2.1.6 化合物6 为白色无定形粉末。ESI-MS m/z:391.35[M+H]+，分子式为 C24H38O4。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.70(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-3,6)，7.53(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-4,5)，4.21(4H,m,H-1′,1′′)，1.67(2H,m,H-2′,2′′)，1.42(4H,m,H-a′,a′′)，1.35(4H,dd,J=8.6,4.5Hz,H-3′,3′′)，1.31(8H,m,H-3′,3′′,4′,4′′)，0.91(6H,t,J=7.6Hz,H-b′,b′′)，0.89(6H,m,H-6′,6′′)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:168.0(C=O)，132.7(C-1,2)，131.1(C-3,6)，129.0(C-4,5)，68.4(C-1′,1′′)，39.0(C-2′,2′′)，30.6(C-3′,3′′)，29.2(C-4′,4′′)，24.0(C-a′,a′′)，23.2(C-5′,5′′)，14.3(C-6′,6′′)，11.2(C-b′,b′′)。光谱数据与文献[11]报道的基本一致，故确定该化合物为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯。

2.2 抗氧化活性评价

2.2.1 对DPPH自由基的清除作用 阳性药Vit C和 Trolox 分别在浓度为 （21.91±0.41）μmol·L-1和（24.13±0.32）μmol·L-1时即可达到半数清除的效果，而化合物1、2的IC50值明显大于阳性药物，表明其对DPPH仅具有较弱的自由基清除效果，而其他化合物在所设浓度范围内均未达到半数清除效果。结果表明化合物1、2具有一定的抗氧化活性。见表1。

2.2.2 对ABTS自由基的清除作用 化合物2对ABTS自由基有较好的清除效果，虽然其清除效果不如阳性药 Trolox，后者的 IC50为（17.31±0.20）μmol·L-1，但在分离得到的化合物中效果最佳。化合物1、3对ABTS自由基仅具有较弱的清除能力，而其他化合物在所设浓度范围内均未达到半数清除效果。化合物2、3均为山奈酚的双糖苷，且双糖均为1分子葡萄糖和l分子鼠李糖组成的寡聚糖，区别在于山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷（3）为葡萄糖6位羟基取代，而山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷（2）为葡萄糖2位羟基取代，保留其醛基，具有还原性，最终导致其抗氧化能力的差异。见表1。

3 讨论

随着现代理论的完善和技术的发展，对于银杏中生物活性成分的研究日益深入，本实验对银杏叶正丁醇部位进行了系统分离，得到了6个化合物，包括2个黄酮苷类和4个其他类化合物，且4个其他类化合物均为该植物中首次分离得到。在这些化合物中，5-羟甲基糠醛（1）可通过清除细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS），影响胞内信号转导来抑制A375细胞的增殖，并通过提高胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）酶活性，减少丙二醛（malondialdehyde，MDA）产生来抑制红细胞溶血，证明其一定的抗氧化作用[12]，这与本实验结果一致。邻苯二甲酸二丁酯（4）可模拟雌激素效应进而促进MCF-7细胞生长和增殖[13]，可导致小鼠巨噬细胞活性降低和细胞膜损伤[14]，能引起大鼠离体胸主动脉收缩[15]等，具有一定的毒性作用。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（6）对肝脏、肾脏、呼吸系统和生殖系统均能产生毒性作用[16]。本实验结果丰富了银杏的化学组成，为阐明银杏的药效物质基础，科学评价药物作用，控制药品质量，提供了一定的理论依据。

表1 化合物1～6的抗氧化活性比较（±s,n=3）Tab.1 Comparison on antioxidant activity among compounds 1～6（±s,n=3)

表1 化合物1～6的抗氧化活性比较（±s,n=3）Tab.1 Comparison on antioxidant activity among compounds 1～6（±s,n=3)

化合物IC50（μmol·L-1）DPPH ABTS Vit C Trolox-1 2 3 4 5 6 21.91±0.41 24.13±0.32 1 156.49±45.37 529.85±11.36＞1 000＞1 000＞1 000＞1 000 17.31±0.20 843.06±8.94 87.48±2.28 200.86±11.72＞1 000＞1 000＞1 000