醒脑静对大鼠脑出血病灶周围星形胶质细胞表达水通道蛋白-4的影响研究*

赵志靖，第五飞虎，邓毅恒，杨利孙

长安医院神经外科(西安 710016)

脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是严重危及广大人民健康与生活的临床常见危重病与多发病，其继发性脑水肿是明显影响患者转归的重要因素之一[1]。基础和临床研究提示，醒脑静能促进脑出血后患者苏醒，缩短昏迷时间，减少并发症发生，目前其机制仍未明确[2]。水通道蛋白-4(AQP-4)主要分布在脑组织，分布于星形胶质细胞、脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜等，在维持大脑水平衡发挥重要作用，目前国内外极少探讨醒脑静相互作用与其机制如何的相关研究。本实验旨在利用动物与细胞实验共同探讨醒脑静对大鼠脑出血病灶周围星形胶质细胞表达AQP-4的作用效果，以期进一步阐明醒脑静减轻脑出血动物模型脑水肿的原理，为临床应用提供参考。

材料和方法

1 材 料 成年雄性清洁级SD大鼠60只，体质量(250±30)g，购自空军军医大学实验动物中心[SCXK(军) 2012-0007]。醒脑静注射液(国药准字Z32020563)购自无锡济民可信山禾药业股份有限公司。大鼠星形胶质细胞株(R1800)购自上海中乔新舟生物科技有限公司。AQP-4抗体(兔抗鼠)购自美国ABCAM公司，山羊抗兔二抗、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自美国THERMO FISHER公司。总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自美国PROMEGA公司。胎牛血清、丙酮酸盐溶液、DMEM培养基均购自美国THERMO FISHER公司。

2 研究方法

2.1 动物模型的建立与分组:参考文献所述方法[3]，采用胶原酶VII定位注射诱发大鼠尾壳核脑出血模型。实验前一周实验大鼠均接受平衡木训练。使用异氟烷气体麻醉大鼠，固定于立体定位仪，暴露实验鼠前囟后1 mm，正中线旁开3 mm处(尾壳核定位处)钻开颅骨，微量注射器注射0.6 U胶原酶VII/3 μl生理盐水，深度为5 mm，注射速度为1 μl/min。注射后停留10 min退针。术后6 h后用Longa FZ评分法进行行为学评分，具体如下：0分，无体征；1分，不能完全伸展进针对侧肢体(左侧)；2分，进针对侧肢体瘫痪，向进针对侧转圈，有追尾现象；3分，不能站立向进针对侧倾倒；4分，有意识障碍。评分达2分以上加上病理学证据可认为模型成功。造模失败补齐动物并重新造模。

将造模成功大鼠按照随机数字表法分为醒脑静治疗组与对照组，给药方法如下：分组后给药一次，醒脑静治疗组大鼠给予腹腔注射醒脑静注射液2 ml/kg，对照组大鼠给予腹腔注射等容量生理盐水。治疗72 h后予以处死取材，处死前进行行为学评分，两组各随机选组20只大鼠脑实质组织提取总蛋白或总RNA后至于-70℃冰箱保存，其余均用来作脑含水量测定。

2.2 行为学观察:参考文献所述方法，利用平衡木评分法对治疗72 h后两组大鼠进行评估，以其观察两组大鼠行为学变化。让大鼠通过升高的平衡木，进入较暗的饲养箱。评分标准如下：0分，能跳上平衡木，在上面行走不会跌倒；1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会少于50%；2分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒机会大于或等于50%；3分，在健侧后肢的帮助下能跳上平衡木，但受累瘫痪侧后肢不能帮助向前移动；4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分，将大鼠放在平衡木上会掉下来。3次测试结果的平均分作为最后成绩。

2.3 脑实质含水量测定：采用干湿质量法，术后48 h即处死两组大鼠进行取材，首先将两组实验大鼠脑组织完整组织称湿重，然后放入恒温电烤箱内，上调温度至120℃，持续8 h，称取干质量。利用公式：脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%进行计算。

2.4 脑实质组织学观察:制备常规标本，进行HE染色，光镜下观察；制备电镜标本，经半薄切片定位制成超薄切片，在透射电镜下观察。

2.5 细胞培养及实验分组:细胞株(R1800)用含10%FBS的DMEM培养基(完全培养液)置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育，当细胞贴壁90%时，用胰酶进行消化传代。首先调整细胞密度，实验前24 h，按照密度1.5×105/cm2接种细胞到预先包被多聚赖氨酸的细胞培养板，15 min后将上清去掉，更换为新鲜含血清培养基，并置于环境调节为37℃、5%CO2细胞培养箱中进行孵育培养。分组处理：①5 ml/L醒脑静组，培养基中添加5 ml/L醒脑静注射液；②10 ml/L醒脑静组，培养基中添加10 ml/L醒脑静注射液；③20 ml/L醒脑静组，培养基中添加20 ml/L醒脑静注射液；④对照组，单纯含体积分数的10%FBS。培养基中培养7 d，提取总蛋白或总RNA后至于-70℃冰箱保存。

2.6 蛋白免疫印迹:将实验中提取的组织或细胞蛋白以100 g/L SDS-PAGE电泳分离，行转膜后，室温封闭，分别加入AQP-4(兔抗，1∶1000)，冰箱4℃行孵育。过夜后，进行彻底洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶2500)孵育2 h，再次进行洗膜，用增强化学发光法显色、显影，凝胶成像分析系统摄像分析，以β-actin为内参。

2.7 逆转录PCR:将提取的组织或细胞总RNA，逆转录得到相应的cDNA，以该cDNA为模板，采用逆转录PCR法检测AQP-4的转录水平，以β-actin为内参。引物由空军军医大学西京医院肝胆外科实验设计，由上海生工公司合成。

结 果

1 两组大鼠生存率、行为学评分及脑实质含水量的差异 对照组大鼠死亡8只，生存率为73.33%，醒脑静治疗组大鼠死亡例数为2只，生存率为93.33%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。平衡木行为学评分法对两组大鼠行为学进行评价，对照组评分为(4.60±0.34)分，醒脑静治疗组评分为(2.63±0.39)分，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。如图1所示，所有大鼠造模后均显示脑实质尾状核出血。对照组大鼠脑组织含水量(80±0.510)%，醒脑静治疗组大鼠脑组织含水量(77±0.351)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2 两组大鼠脑组织超微结构的差异 两组大鼠脑组织常规HE染色，光镜下可见两组大鼠脑实质中可见血肿，且血肿周围组织肿胀，细胞呈气球样变、坏死，炎性细胞浸润以中性粒细胞为主。相对于对照组，醒脑静治疗组间质水肿和炎性细胞浸润明显减轻。透射电镜观察显示，对照组大鼠脑实质中星形胶质细胞胞体增大，呈气球样变，胞质疏松分散，细胞器减少，细胞核增大，可见部分细胞核体肿胀，少数细胞表现为坏死，醒脑静治疗组均未发现类似表现(图2)。

3 两组大鼠脑实质AQP-4蛋白及mRNA表达的差异 醒脑静治疗组大鼠脑组织AQP-4蛋白表达量显著高于对照组表达量，两组比较差异有统计学意义。同样，醒脑静治疗组大鼠脑组织AQP-4 mRNA表达量显著高于对照组表达量，两组比较差异有统计学意义(P<0.05图3)。

4 醒脑静对星形胶质细胞表达AQP-4蛋白及mRNA的影响 相对于对照组，5 ml/L醒脑静可上调AQP-4蛋白及mRNA的表达，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且随着醒脑静浓度递增，AQP-4蛋白及mRNA的表达也呈现递增，两组比较差异有统计学意义(P<0.05图4)。

讨 论

由于血脑屏障的破坏，脑出血后首先出现的为血管源性脑水肿，随着细胞代谢障碍，继发出现的细胞毒性脑水肿起主导作用，最终导致颅内压明显升高危及患者生命。目前研究认为，炎症因子释放、激活相应的信号通道与脑出血后病灶周围组织水肿的发生密切相关[4-7]。醒脑静注射液属于中成药，是由安宫牛黄丸所改成的水溶性的注射液，主要有麝香、郁金、冰片等中药成分提取而成。已有的研究表明醒脑静对于清除血脑屏障及自由基，尤其对患者血清中的肿瘤坏死因子、白介素-6、白介素-8等炎症因子具有抑制作用，从而达到保护脑水肿区域脑细胞的重要作用[8]。本研究采用胶原酶VII定位注射诱发大鼠尾壳核脑出血模型，给模型大鼠腹腔分别注射醒脑静与等容量的生理盐水，造模72 h后，醒脑静治疗组大鼠生存率为93.33%，明显高于对照组，经醒脑静治疗后的脑出血大鼠在肢体对称平衡方面也得到改善，醒脑静治疗组评分为(2.63±0.39)分，对照组评分为(4.60±0.34)分，两组比较差异有统计学意义。进一步组织学观察发现，在光镜下，相对于对照组，醒脑静治疗组间质水肿和炎性细胞浸润明显减轻。透射电镜观察显示，对照组大鼠脑实质中星形胶质细胞胞体增大，呈气球样变，胞质疏松分散，细胞器减少，细胞核增大，可见部分细胞核体肿胀，少数细胞表现为坏死，醒脑静治疗组均未发现类似表现。体内实验显示，醒脑静治疗可减轻脑出血后周围组织脑水，提高模型大鼠的生存率，改善模型大鼠肢体对称平衡。

星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多的细胞，它参与血脑屏障的构成，在脑实质中，星形胶质细胞与血管内皮细胞关系密切，研究表明，星形胶质细胞在血管源性脑水肿的发生、发展以及消退中起重要作用[9-12]。脑组织中水通道蛋白主要为AQP-4，其在脑内主要集中在脑室系统的室管膜、脑表面的软脑膜、星形胶质细胞等，是星形胶质细胞、脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要通道蛋白，调节脑脊液重吸收、脑细胞渗透压水平等，在维持大脑水平衡发挥重要作用[13-14]。目前研究显示，若AQP-4基因被敲除，即可诱发实验动物发生血管源性脑水肿[15-16]。脑出血后首先表现的为血管源性脑水肿，本研究发现，模型大鼠脑组织表达AQP-4mRNA及蛋白均明显下降，同样支持AQP-4功能缺失参与血管源性脑水肿的发生。本实验显示，醒脑静通过刺激模型组大鼠脑实质AQP-4mRNA及蛋白的表达，减轻脑出血后脑水肿的程度，从而改善模型大鼠的生存率及肢体对称平衡。

脑出血后血脑屏障破坏，渗出到血管外的血液成分、凝血酶、血清等均参与血管源性脑水肿的形成。目前研究发现，含血清培养可导致星形胶质细胞发生细胞水肿。在本研究中发现，加入10%FBS后，在倒差显微镜下可发现星形胶质呈气球样变，细胞胞体增大，胞质疏松，细胞核增大，甚至部分细胞核核体肿胀破裂。培养基中加入醒脑静注射液，倒差显微镜下观察可见星形胶质细胞胞质浓缩，破裂细胞核明显减少。进一步蛋白免疫印迹及逆转录PCR发现，随着加入培养基中醒脑静浓度增加，星形胶质细胞AQP-4mRNA及蛋白的表达均明显上升，两组比较差异有统计学意义，显示醒脑静可通过上调AQP-4表达，缓解细胞水肿的发展，然而其具体诱导途径尚需进一步深入研究。

综述所述，本研究采用胶原酶VII定位注射诱发大鼠尾壳核脑出血模型，证实了经醒脑静治疗后的脑出血大鼠无论在生存率还是在肢体对称平衡方面均得到改善，其机制可能是醒脑静可直接刺激星形细胞上调AQP-4蛋白及mRNA的表达，从而缓解脑出血后血管源性脑水肿的进展，这为未来醒脑静用于治疗脑出血后脑水肿治疗提供新的理论支持。