猴头菇多糖对胃肠道益生菌生长的影响

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(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350028;2.福建农林大学菌物研究中心,福建福州 350028)

胃肠道是人消化及免疫的重要器官,富集着丰富的微生物群落[1]。这些胃肠道益生菌群在食物消化和营养吸收、改善肠道微生态平衡,免疫调节促进机体健康等方面都具有重要的作用[2]。胃肠道益生菌主要分为3大类:双歧杆菌类、乳酸杆菌类和革兰氏阳性球菌。其中保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌被认为是3种重要的益生菌[3-4]。保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)属于乳酸杆菌属,在牛奶发酵中具有重要的应用,是乳酸菌中产酸量最高的菌种[5],研究发现保加利亚人长寿的秘诀在于其长期饮用发酵乳[6];青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)多见于婴幼儿的肠道内,对婴儿的发育具有重要作用,不仅能够调整肠道菌群,防止便秘,还能降低结肠癌的发病率等[7-8];嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)具有改善肠道功能，提高机体免疫能力，缓解乳糖不耐症等多种生理功效[9-10]。这3种益生菌可定植到人体肠道内,进一步抑制有害肠道微生物的生长[11-12]。

许多食用菌中的提取物对改善和调节肠道微生物均具有一定的作用。富硒猴头菇冻干粉可显著增多小鼠肠道中双歧杆菌和乳杆菌数量,具有调节小鼠肠道菌群的作用[13];香菇的酶解物可改善小鼠肠道菌群环境和调节肠道功能[14];灵芝多糖可以通过改善调节小鼠肠道的微生物群落结构以及维持肠屏障来降低小鼠的肥胖率及其炎症[15];金针菇、香菇、黑木耳、平菇、双孢菇、杏鲍菇6种食用菌子实体水提物对粪便悬液中肠道菌群的菌群种类和菌群结构具有一定的影响[16]。猴头菇(Hericiumerinaceus(Bull.)Pers.)作为一种大型食药用菌,属于担子菌亚门、担子菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属[17]。中医学认为,猴头菇性平、味甘、利五脏、助消化;具有健胃、补虚、抗癌、益肾精之功效[18]。大量研究结果显示,猴头菇提取物营养丰富,化学成分众多,其中多糖被认为是猴头菇具有多种药理活性的物质基础之一[19-21]。猴头菇多糖有抗氧化和清除DPPH自由基的功能,较于其他杏鲍菇,平菇等真菌多糖具有更显著的效果[22]。猴头菇子实体对于胃、十二指肠溃疡等具有疗效,而猴头菇子实体小分子提取物能显著地抑制幽门螺杆菌的生长[23]。

但关于猴头菇多糖对于上述3种胃肠道益生菌的直接生长影响研究较少。因此,本研究拟在培养基中添加不同含量的猴头菇多糖,检测这3种胃肠道益生菌的生长情况,同时通过模拟人体胃肠道环境,探究猴头菇多糖对3种益生菌在胃液和肠液中耐受力的影响,为猴头菇功能食品的研发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猴头菇多糖 纯度为64%,福建省尤溪县天茸生物技术有限公司;胰蛋白酶250 NFU/mg、胃蛋白酶≥250 U/mg、L-盐酸半胱氨酸 北京索莱宝科技有限公司;保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌 北京川秀科技有限公司,经实验室自行分离获得纯菌株;青春双歧杆菌菌株 上海沪峥生物科技有限公司,编号为:ATCC 15703;TPY培养基(青春双歧杆菌) 青岛海博生物科技有限公司。

UV-2600紫外分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;明澈TM-D2超净纯水系统 德国Thermo Scientific;SPX-250生化培养箱 宁波江南仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 基础培养基(保加利亚乳杆菌):蒸馏水1000 mL,牛肉膏10.0 g,蛋白胨5.0 g,NaCl 5.0 g,葡萄糖5.0 g,醋酸钠3.0 g,L-盐酸半胱氨酸0.5 g,酵母粉3.0 g,调节pH至6.8左右。

TYC培养基(嗜热链球菌):蒸馏水1000 mL,蔗糖5.0 g,胰蛋白胨15.0 g,亚硫酸钠0.1 g,乙酸钠2.0 g,酵母浸粉5.0 g,L-盐酸半胱氨酸0.2 g,NaCl 1.0 g,NaHCO32.0 g,Na2HPO42.0 g,调节pH至7.3左右。

1.2.2 菌种活化 从保存的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌菌种制剂中分别取一环接种于基础培养基、TPY培养基和TYC培养基,于37 ℃培养箱培养48 h后,取0.1 mL接种于相应液体培养基培养48 h,传代两次后得到相应活化的菌种。其中青春双歧杆菌为厌氧型微生物,故将其置于装有厌氧产气袋的不透气乐扣箱培养。

1.2.3 菌种稀释度的确定 取3%已活化的液体菌种接种到装有20 mL基础培养基中的18 cm×180 cm试管,待达到菌种培养稳定期时(约10～18 h),取1 mL菌液稀释,稀释梯度为10-1～10-8,分别取0.1 mL的菌液于相应平板中涂布。经培养后计数,记录菌落数在30～300 cfu的平板和相应的稀释倍数,为正式平板计数确定合适的三个稀释度。

1.2.4 体外胃肠模拟液的制备 按2015版《中国药典》配制体外胃模拟液:以磷酸缓冲盐溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.4)替换配制试验培养基中的水,用37%的盐酸溶液调节实验培养基pH至3.0。于高压灭菌锅(121 ℃,15 min)中灭菌,用无菌水将一定量经紫外灭过菌的胃蛋白酶溶解,添加到冷却至室温的培养基中,配制成含0.5%胃蛋白酶的试验培养基,体外模拟胃环境。

按2015版《中国药典》配制体外肠模拟液:以PBS缓冲液替换配制试验培养基中的水,用37%的盐酸溶液调节实验培养基pH至7.0。于高压灭菌锅(121 ℃,15 min)中灭菌,用无菌水将一定量经紫外灭过菌的胰蛋白酶溶解,添加到冷却至室温的培养基中,配制成含1%胰蛋白酶的试验培养基,体外模拟肠环境。

1.2.5 三种益生菌生长曲线的检测 取0.1 mL活化的液体菌种,接种于39个装有20 mL基础培养基大试管中,编号分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h,每个编号设置3个试管,于37 ℃培养箱中培养。然后测定每个培养时间点的菌液在600 nm处的吸光值,取三个试管吸光值的平均值绘制生长曲线。测得的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌生长至稳定期的时间分别为T1、T2、T3。

1.2.6 猴头菇多糖对三种益生菌体外生长的影响试验 分别取0.6 mL的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌菌液接种至20 mL的基础培养基(CK)与分别添加0.3%、0.5%、0.7%猴头菇多糖的基础培养基中。再将保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌的上述培养基分别于37 ℃培养箱中培养T1、T2、T3时间后,各取1 mL菌液根据预实验测定结果进行相应的稀释,每个稀释液各取0.1 mL,涂布于选择性培养基平板中,于37 ℃培养48 h后计算菌落数。每组试验重复三次。

表1 不同稀释度的三种菌在猴头菇多糖平板上的菌落数情况Table 1 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on Hericium erinaceus polysaccharide plate

注:-表示数量较多,无法计算。

1.2.7 添加猴头菇多糖对三种益生菌在模拟胃液、肠液培养基中的耐受性试验 分别于模拟胃液试验培养基和模拟肠液试验培养基中加入7%猴头菇多糖提取物代替葡萄糖,再分别以不含猴头菇多糖胃液和肠液试验培养基为对照组(CK),分别接种0.6 mL三种益生菌活化菌液,混匀后立即取1 mL稀释,于平板中涂布,经37 ℃培养48 h后计数,为0 h的菌数。将试验培养基放入37 ℃培养箱中培养。3 h后取出试验培养基,取1 mL稀释,于平板中涂布,经37 ℃恒温箱中培养48 h后计数，其为3 h平板菌落数,每组试验重复三次。然后分别计算存活率,存活率为3 h后的菌落总数与0 h的菌落总数的比值。

1.3 数据处理

实验数据统计分析采用SPSS 17.0,用Originpro 8.0、Excel 2010进行做图。

2 结果与分析

2.1 三种益生菌生长曲线

保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌的生长曲线如图1所示,三种乳酸菌在0～4 h都处在调整期。4 h以后,三种乳酸菌都渐渐步入指数期。保加利亚乳杆菌在18 h左右进入稳定期,青春双歧杆菌在14 h左右进入稳定期,而嗜热链球菌在10 h左右进入稳定期。因此,在研究猴头菇多糖对乳酸菌体外生长影响试验与模拟肠胃试验中,三种乳酸菌的菌种最佳培养时间分别为:18 h(保加利亚乳杆菌)、14 h(青春双歧杆菌)、10 h(嗜热链球菌)。

图1 三种乳酸菌生长曲线Fig.1 Growth curves of three kinds of lactic acid bacteria

2.2 猴头菇多糖对三种益生菌体外生长的影响实验结果

在不同多糖添加量的培养基中培养3 h后,取样进行平板计算,实验结果见表1和图2。保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌分别以10-6、10-5和10-5为有效稀释度,在培养基中添加0.3%的猴头菇多糖,三种益生菌的生长量均明显增加。当培养基中猴头菇多糖含量由0.3%增加至0.7%时,保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌的生长量均增长明显,达到显著性差异(P<0.05)。而嗜热链球菌的生长量随着猴头菇多糖含量逐渐增加时增速放缓,0.5%与0.7%的猴头菇多糖添加量组中,嗜热链球菌的生长量没有显著性差异(P>0.05)。与山药多糖(12.5%浓度,双歧杆菌数量增加最显著)[24]和白术多糖(2.0%浓度,双歧杆菌数量增加最显著)[25]相比,只需更低的猴头菇多糖量即可促进双歧杆菌的数量增加,显示出猴头菇多糖对三种益生菌的促进增长作用更强。

图2 猴头菇多糖含量对三种益生菌生长的影响Fig.2 Effects of polysaccharide fromHericium erinaceus on the growth of three probiotics注:对于同一种益生菌，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表2 不同稀释度的三种菌在猴头菇多糖的模拟胃液平板上菌落数情况Table 2 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on simulated gastric fluid plate with Hericium erinaceus polysaccharides

注:-表示数量较多,无法计算;同一菌种不同处理的菌落总数比较,用a、b、c和d表示显著性差异(P<0.05)。

表3 不同稀释度三种乳酸菌在猴头菇多糖的模拟肠液平板上菌落数情况Table 3 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on simulated intestinal juice plate with Hericium erinaceus polysaccharides

注:-表示数量较多,无法计算;同一菌种不同处理的菌落总数比较,用a、b、c和d表示显著性差异(P<0.05)。

2.3 添加猴头菇多糖对三种益生菌在模拟胃液中的耐受性影响

分别用含7%猴头菇多糖、pH为3.0的模拟胃液培养基对三种菌培养3 h后,取样进行平板计算(表2),结果显示:三种菌的有效稀释度均为10-3,未添加猴头菇多糖的培养基培养3 h后,保加利亚乳杆菌存活率为64.32%;添加7%猴头菇多糖的培养基培养3 h后,保加利亚乳杆菌的存活率为71.83%,存活率提升了7.51%。而青春双歧杆菌的存活率由原来的67.52%提升到69.43%,提升了1.91%;嗜热链球菌的存活率由原来的67.82%提升到68.93%,提升了1.11%。因此,猴头菇多糖能够显著(P<0.05)增强保加利亚乳杆菌对胃液的耐受性,而对青春双歧杆菌和嗜热链球菌的改善作用不是很显著(P>0.05)。

2.4 添加猴头菇多糖对三种益生菌在模拟肠液中的耐受性影响

分别用含7%猴头菇多糖、pH为7的模拟肠液的培养基对三种菌进行培养3 h后,取样进行平板计算(表3),结果显示:三种菌的有效稀释度均为10-3,未添加猴头菇多糖的培养基培养3 h后,再培养后保加利亚乳杆菌存活率为77.52%;添加猴头菇多糖的培养基培养3 h后,再培养后保加利亚乳杆菌的存活率为81.32%,存活率提升了3.80%。而青春双歧杆菌的存活率由原来的72.61%提升到73.46%,提升了0.85%;嗜热链球菌的存活率由原来的67.24%提升到78.62%,提升了11.38%。因此,猴头菇多糖能够显著增强嗜热链球菌(P<0.01)和保加利亚乳杆菌(P<0.05)对肠液的耐受性,而对青春双歧杆菌的改善作用不是很明显(P>0.05)。

3 讨论

猴头菇养胃功效作用的肠道微生物的种类仍未明确[7,12]。本研究通过在乳酸菌基础培养基中添加不同浓度的猴头菇多糖,发现猴头菇多糖能够促进保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌和嗜热链球菌胃肠益生菌的生长。其中保加利亚乳杆菌与青春双歧杆菌的生长量随着猴头菇多糖添加量的增多而增加。而嗜热链球菌的生长量在猴头菇多糖含量为0.5%时增速放缓。通过模拟人体胃肠道环境,发现猴头菇多糖能够显著增强保加利亚乳杆菌对胃液和肠液的耐受性,显著增强青春双歧杆菌对肠液的耐受性,增强嗜热链球菌对肠液的耐受性。

多糖是食用菌重要的生物活性物质之一,可作为胃肠道益生菌的能源物质,还可促进这些益生菌对肠道细胞的粘附,从而保持胃肠道正常的黏膜免疫系统[18,20,26-27]。猴头菇养胃功效的作用机制虽未明确,从本研究的结果可以推断猴头菇多糖的作用可能是一方面增强一些肠胃益生菌对胃液、肠液的耐受力,从而调节胃肠内的益生菌的菌群结构;另一方面,猴头菇多糖能促进胃肠内原有益生菌的生长,促进胃肠内部的益生菌数量,从而起到改善调节胃肠的作用。本研究为猴头菇改善胃肠道的功能性食品的开发提供数据支持。当然,本文对于猴头菇多糖具体是如何调节肠胃内微生物的生长的机理尚不清楚,需要进一步的深入研究。