铜绿假单胞菌检测方法研究进展

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(1.武汉食品化妆品检验所,湖北武汉 430014;2.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA),假单胞菌属,对营养条件要求较低,且易在潮湿环境中存活,因而在自然界中分布很广泛,不论土壤还是水环境都能检测到,甚至在人体的皮肤、呼吸道以及消化道等部位都有定植。在蔡双福等[1]的调查中发现,在食品领域,凉拌菜、熟肉制品、饮用水等产品经常存在被PA污染的状况。此外,由于PA能产生多种致病因子,很容易引起免疫力低下的病人感染。在治疗过程中若不合理地使用抗生素,还会引发PA耐药性问题,因此PA引起的感染以及其耐药性都会给人类健康带来很大的潜在危害,如何有效检测耐药性PA也成为医学界重点关注的问题[2]。

GB 8538-2016《饮用天然矿泉水检验方法》[3]和GB 19298-2014《包装饮用水》[4]都明确要求PA不得检出,最新版《化妆品安全技术规范》(2015年)[5]也要求化妆品中的PA不得检出。然而多个学者研究表明,在PA的检验过程中存在一些问题,比如漏检[6]、传统培养法检验效率不高[7]等问题,因此PA的有效检测问题也越来越受到学者的关注。

在微生物检测领域,分子检验技术日趋成熟,以蛋白分析为基础的免疫法、质谱、光谱等大型仪器分析方法,随着信息技术、光电技术和仪器制造业的发展,在实现自动化微生物鉴定中的优势逐渐显现。由于PA自身的其基因组庞大,能依据环境的变化精密调节各种毒力因子的合成[8],因此无论是以鉴定特定基因为基础的检验技术,或是以识别特异性蛋白为基础的检验技术,在分离鉴定PA的过程中都存在一定的局限性。近些年学者们仍在不断尝试,以期实现迅速并准确地分析各类样品中的PA污染状况。本文将从传统检测方法，以核酸、蛋白质、全细胞为研究对象的检验方法，对近几年PA的检测方法的发展进行综述。

1 传统培养法

鉴定特定微生物的传统方法一般是先观察微生物的形态学特征,再辅以生理生化确认实验进行判断菌种类型。传统培养法虽然实验周期长,但因其实用性、可靠性强,依然是不可忽视的检测方法[9]。许潘健等[10]从分析PA的代谢产物入手,将红枣、党参、枸杞子等中药加入营养琼脂以观察对PA绿脓素产生的影响,结果表明与金氏B培养基相比,中药琼脂更能有效地促进PA绿脓素的产生,从而使传统培养检验PA方法的效率有了进一步提升。Akoglu等[11]在十六烷三甲基溴化铵培养基中加入苯扎溴铵,改良后的培养基应用于乳制品的检测,发现苯扎溴铵对荧光假单胞具有良好的抑制作用,有效地提高了原培养基对PA的选择性。Weiser等[12]评价了四种培养基(乙酰胺琼脂、假单胞CN培养基、假单胞分离培养基、显色培养基)对PA的分离效果,结果表明,乙酰胺琼脂选择性较差,而显色培养基选择性最高可达70%,灵敏度可达到95%。高飞等[13]利用PA产生一种特殊酶来水解Pseudalert试剂中荧光底物,并依据酶在水解底物的同时产生的荧光变化来判断样本中是否存在PA。在实验过程中采用含Pseudalert试剂的生理盐水稀释样本,加入97孔无菌定量盘内在(36±1) ℃培养箱中培养24 h,对有黄色反应且有蓝色荧光的样本,通过查相关MPN表对PA进行定量,将该方法用于化妆品中可在24 h内即可得到结果,无需进行验证试验。Sartory等[14]也评价了基于Pseudalert试剂的MPN法与滤膜法定量检测方面的差异,结果同样显示Pseudalert-MPN法在检测泳池水样中的PA时表现出较好的时效性。

传统培养法对实验条件要求不高,同时可以直观地观察结果,很适合基层实验室开展实验,但PA检测中亟待解决的问题仍然是培养时间长,且在同一种培养基上PA的菌落形态也呈多样性,需要确认实验进一步证实结果[7]。目前市面的选择性培养基特异性仍然有待提高,尤其是不能避免其他革兰氏阴性菌的生长,选择更具特异性的生化特征作为PA分离标准,以区别样品中其他类似菌如荧光假单胞、恶臭假单胞菌,依旧是未来培养法研究的主要方向。

2 以核酸为分析目标的检测方法

随着检测技术的不断发展,分子生物学技术凭借强特异性、高灵敏度、简便省时等特点,已经被广泛应用在PA的检测中,甚至针对PA基因组的测序工作也已经完成[15],但全基因测序方法在日常检验工作中仍过于繁琐,目前常用的分子生物学检验方法主要有以下几类:以聚合酶链式反应技术为基础的单一PCR、多重PCR、定量PCR技术、环介导等温扩增技术、基因芯片技术和新兴的核酸生物传感器技术[16]。

2.1 PCR技术

从普通PCR、单一定量PCR、多重定量PCR到荧光定量PCR,这一类的检验技术都已经应用在PA的检验中。由于PCR法对DNA片段浓度有一定要求,为了提高检测灵敏度,很多研究者在预处理过程中采用预增菌[17]、磁珠富集、巢式PCR方法来获得较高浓度的目标DNA片段[18]。此外普通PCR法不能区分死菌与活菌,导致实验结果显示假阳性[19],在发现叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)和叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)能与死细菌基因组DNA结合后,已经有学者建立了EMA-PCR[20]或PMA-PCR方法[21],并将该方法应用到样品中PA活菌的检测中。为了进一步提高检验灵敏度和特异性,在普通PCR反应体系中加入荧光基团或染料,通过扩增过程中荧光信号的累积来反映体系中模板浓度变化的荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测法发展起来。基于荧光定量PA检测方法也已经有很多学者进行了尝试[22]。依据实验目的的不同,qPCR又可以分为单重定量和多重定量法。在利用多重定量PCR检测PA主要有两个研究方向,一种是在同一反应体系中针对包括PA在内多种微生物的目的基因进行扩增,可以同时完成几种微生物的检验[23];另一种是在一个体系内对PA的多个目的基因进行扩增[24],以提供更准确的检测信息。与常规的核酸扩增法相比,环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术利用4个引物识别靶基因6个区域,能在恒温条件下快速完成核酸扩增,因此是一种灵敏度更好、效率更高、结果判定更简单而且经济有效的检验方法[25]。表1列举了近几年应用分子生物方法检验PA不同靶点的部分实例。

由表1可以看出,凭借高灵敏度、便携性好、检验条件要求低等特点,LAMP技术成为继PCR技术后近些年受研究人员青睐的PA检测方法之一。总体来说,以核酸聚合酶链式反应为基础的检测方法能够达到快速、灵敏、高精确度的检测,但反应难以控制因DNA污染出现的假阳性和样品中其他物质干扰出现的假阴性。

2.2 高通量核酸分析技术

近些年发展的基因芯片技术,通过集成定量PCR同一反应体系,实现了同时对PA的多个目的基因进行扩增,又可以同时针对包括PA在内的不同微生物的目的基因扩增,在检验效率及PA阳性检出率方面有了进一步的提高。董进浪等[31]以酶显色技术为基础,根据细菌16S rRNA基因特点,构建了能同时针对包括PA在内的8种细菌性肺炎常见的病原菌进行检验的基因芯片,这种基因芯片法检测速度快、准确性高、通量高,还具有特别的诊断价值,但制作过程较繁琐复杂,成本偏高。

表1 不同靶点检测PA应用实例Table 1 Application of different target gene used for detection of Pseudomonas aeruginosa

最近发展起来的高通量测序技术使得微生物检验能够以更高的速度进行大规模的平行分析,并进一步带动了检测技术的发展。美国FDA发布的“全基因组测序技术(WGS)应用问答”更有助于研究人员在疾病暴发时可以更快地鉴定致病微生物,明确致病菌的毒力因子,确认疫情的源头,起到预防食源性疾病暴发的作用。在防治PA引发的感染方面,Witney等[32]通过对英国两家医院中引起泛耐药性PA进行的全基因组测序分析,不但确定了该菌株的耐药基因、毒力因子,并且发现该菌株的基因组与近期感染者、水槽及下水道中菌株具有高度相似的序列,从而得出该菌株已经在医院中流行多年的结论。

2.3 DNA生物传感技术

随着人们对低成本高精度检测器的进一步追求,利用DNA为感应元件,通过将DNA与其他元器件相互作用的生物信号转换成物理信号的生物传感器也在PA的检测中广泛应用起来。Amini等[33]以ETA基因为靶基因,设计出一种以DNA条形码技术为基础的检测PA的荧光生物传感器。该传感器以纳米金粒子(GNPS)连接特异性识别ETA基因的探针和条码DNA,纳米磁性粒子(MNPs)连接特异性捕获探针识别ETA基因另一部分序列。将两种纳米粒子与ETA基因混合后,ETA基因与MNPs复合物(MNPs-2ndDNA探针-ETA基因)结合在基底表面,再结合GNPS形成三明治结构(MNPs-2ndDNA探针-ETA基因-1stDNA探针-GNPs-条形码DNA)。采用二硫苏糖醇(DTT)处理后,三明治结构中的条形码DNA被释放,通过检测此过程中产生的发光信号,可以间接得到ETA基因的含量。特异性实验结果表明,与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌以及霍乱弧菌并无交叉反应,在最佳条件下,该方法检出限为1.2 ng/mL。同样采用纳米技术,Amini等[34]还设计出另一种以核酸内切酶为基础的生物传感器,该技术采用柠檬酸盐还原法制备GNPS,使其形成带负电荷的纳米粒子,因无法聚集而使其表面呈红色。将红色GNPS连接特异性探针后再与ETA基因杂交,此时在反应体系中加入BamHI核酸内切酶,直至将GNPS上目的基因全部切掉。在NaCl存在的条件下,GNPS不再带负电荷而发生聚集而呈紫色,通过检测过程中的颜色变化可以实现PA的定量检测。在目标基因浓度达12.5 ng/mL时,可以凭肉眼观察到明显颜色变化。Ji等[35]研制出一种水平剪切表面声波(SH-SAW)生物传感器,其基本原理是在交流电信号刺激下,SH-SAW会沿压电基片表面传播。当传播路径上载荷的质量发生变化,SH-SAW的振幅和相速度将随之变化,进而用这些变化来量化生物探针及其目标序列的特定杂交情况。该传感器采用LiTaO3压电基片,通过测定特异性ss-DNA探针与PA互补序列的结合产生的相位漂移来检测PA,该传感器对PA核酸的检出限达9.5 ng/mL。虽然压电晶体型生物传感器有着操作简单、节省时间等优点,但灵敏度还需要进一步提高。

从表1的实例中观察,在医学检验领域,各项研究中应用的样本类型比较集中,样本主要为血液、尿液或拭子样本,LAMP方法和多重定量PCR方法在医学样本中应用已经可以实现不经过增菌直接检验,常用的靶基因都有较好的灵敏度,大多数文献报道的检验方法都在这几类样本中应用较好,而Ertugrul等[36]的研究进一步表明,各个毒素基因中fliC和toxA基因保守性更好;环境领域的样本,主要样本类型为水样,因为样本成分相对简单,因此各类检测方法也有较好的应用效果;但在食品领域中,高脂肪、高蛋白和高盐的环境会对分子方法的应用造成一定阻碍[37],因此针对这一领域的研究主要是液体类样本,但由于菌体浓度限制,增菌或磁珠富集步骤仍然不可避免突破食品领域这一限制,如何最快富集PA,提高快速检测的周期,方便监督机构迅速作出判断,评估风险就显得尤为重要。

3 以多肽、蛋白质为分析目标的检测方法

目前,以多肽、蛋白质为基础开展的检测研究主要包括基于抗原抗体结合的免疫法和基于细菌胞膜成分或表达的特异蛋白进行鉴别的质谱、光谱分析法。

3.1 免疫传感器

免疫分析法是通过用酶、荧光或放射性物质对抗体进行标记,在发生抗原抗体结合反应后放大免疫信号,从而实现对微生物进行鉴定。Bekir等[38]设计的免疫传感器将多克隆抗PA抗体固定于吡咯-3-羧酸玻碳电极上,并采用循环伏安法、阻抗谱法监控实验过程,实验结果表明该传感器灵敏度范围达10～107CFU/mL。纳米金(AuNPs)材料因能与之结合的生物大分子种类多,催化活性高且对电子的传递效率能有所提高,也广泛应用在各类生物传感器中。Krithiga等[39]将新型纳米技术与传感器技术相结合,研制的PA免疫传感器采用钙/果胶-纳米金粒子修饰的玻碳电极固定单克隆抗体,检出限达9×102CFU/mL,灵敏度范围为10～107CFU/mL,并具有高稳定性、高选择性、高重现性及高复用性等特点。Ellairaja等[40]根据荧光探针与葡萄糖-银纳米粒子结合时荧光信号减弱、荧光探针-葡萄糖-银纳米粒子-IgG结合时信号增强的原理,研制以纳米银技术为基础的传感器,通过监测与纳米银颗粒-探针复合物结合时增强的荧光信号完成PA的检测,该传感器最低检测限达1.5 CFU/mL,并成功地完成水、土壤以及牛奶、果汁等食物中的PA检测。

3.2 质谱分析技术

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)主要通过分析细菌胞膜成分或表达的特异蛋白对细菌进行种群的鉴别。第一版使用MALDI-TOF-MS鉴定微生物的指导方针CLSI M58已于2017年4月发布,这标志着业界已经认可将质谱技术作为主流技术用于微生物常规鉴定。崔学文等[41]用MALDI-TOF-MS对15株PA和8株干扰菌进行图谱采集,应用BioTyper和FlexAnalysis对图谱进行离子分析和比对鉴定,通过比较,MALDI-TOF-MS对15株PA鉴定结果和VITEK完全一致,这充分证明了这一技术的可靠性。Lüthje等[42]也成功地利用MALDI-TOF-MS对显色培养基上386株菌(含PA)进行分析,检测结果基本不会受到显色培养基中特殊成分的干扰。Lin等[43]将血液PA阳性培养物经过两段离心、溶血处理,利用MALDI-TOF-MS技术成功检测到PA,大大缩短检验时间,降低了实验成本。Pereira等[44]先利用扫描电子显微镜和原子显微镜来观察玻璃及聚丙烯上形成的生物膜不同时期的形态变化,再利用MALDI-TOF-MS技术对不同材料上PA进行分析,根据树状图进行聚类分析,结果表明,MALDI-TOF-MS技术能够成功区分不同阶段生长的PA。表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术也是通过检测特异性蛋白来实现菌株的鉴别。肖代雯等[45]利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱采集20株PA的蛋白指纹图谱,在相对分子量4000～11000 Da范围内进行筛选,初步建立以19个稳定表达的蛋白峰构成的蛋白指纹模型。对43株PA鉴定结果与传统微生物学鉴定方法及分子生物学结果相比符合率为97.7%。

4 以代谢产物为分析目标的检验技术

PA生长过程中分泌的次生代谢产物种类繁多,如鼠李糖脂、胞外多糖、酶类化合物几丁质酶、酸性磷酸酶[46]、碳青霉烯酶[47]。但在检测领域,最受关注的次级代谢物是一类具有氧化还原活性的含杂氮环的小分子物质,统称为吩嗪[48]。吩嗪类物质主要包括绿脓菌素(PYO)、吩嗪-1-羧酸、吩嗪1-甲酰胺、5-甲基吩嗪-1-羧酸等。但由于很多细菌都会产生吩嗪类物质,唯有PYO,不但具有特殊的氧化还原活性和有特殊的颜色,而且是一种仅由PA特异性产生的化合物[49],所以成为PA最理想的标志物之一。

4.1 电化学法

4.1.1 以绿脓菌素(PYO)为分析目标 以分析PYO间接检测PA的方法主要采用电化学方法。其主要是通过将特定代谢物在基质中的电化学信号转换成光电信号来实现的。Oziat等[50]以玻碳电极为工作电极,以Ag/AgCl电极为参比电极,以铂箔作为对电极。利用循环伏安法和方波伏安法对4种主要代谢产物,2-庚基-4-喹诺酮(HHQ)、假单胞菌喹诺酮信号分子(PQS)、绿脓菌素(PYO)和2′-氨基苯乙酮(2-AA)的电化学特性进行了分析。结果表明,在低电位条件下HHQ和2-AA反应电位相近,较难区分,需要通过调整pH和提取样本上清液才能达到较好的分离效果。因此PQS和PYO能在低电位下产生分离度较好的峰型,由此判断这两种代谢物是最适合电化学检测PA的生物标志物。Sismaet等[51]设计的一次性丝网印刷电极传感器由碳基工作电极和对电极辅以Ag/AgCl材料的参比电极组成,通过分析伤口排出物的方波伏安图可以判断是否存在绿脓菌素成分,当样本中存在PA产生的绿脓菌素时,伏安图中会出现明显的峰。这种电化学方法无需样品制备,只需要7.5 μL样品,不到1 min时间即可完成分析。通过与16S rRNA测序结果比较,该传感器对假单胞菌的检测灵敏度可以达到71%。Webster等[52]设计的碳电极传感器,以人血、尿液、痰和肺泡灌洗液样本,检测PA绿脓菌素完成一次检测只需要5 min左右的时间,非常快捷,而且整个检测是直接基于样本进行的,不需要经过筛选分离PA的环节。Santiveri等[53]的研究进一步证明了绿脓菌素产生的电化学信号非常明显,即使在PA与多种致病菌混合培养时,仍然能有效鉴别出PA。新型纳米材料石墨烯因具有比表面积大、导电性良好、吸附力强、生物相容性高等特性,也被广泛应用在PA电化学传感器中。Gandouzi等[54]以石墨烯-金纳米颗粒搭建传感平台检测绿脓菌素,检出限为0.33 μmol/L,在实际样品人血清、唾液和自来水的检验中都有很好的应用效果。Cernat等[55]改用纳米复合材料石墨烯-聚吡咯-纳米金材料搭建传感平台检测绿脓菌素,这种材料在电子转移速率和增加活性表面积方面表现更突出,在灵敏度、自动化程度、价格成本等方面具有更大优势。

4.1.2 以挥发性物质为分析目标 除了以绿脓菌素为研究对象外,Suarez-Cuartina等[56]利用电子鼻技术,通过对PA代谢产生的挥发性有机物质(VOC)的分析达到检测的目的,具有检测速度快、灵敏度高、操作简单等特点。通过分析病人呼出气体的挥发性有机成分就能确定PA的存在。但在灵敏度、稳定性方面,电子鼻的气体传感技术还需进一步提高。此外,如何在短时间内同时检测多种微生物方面还需要进一步深入的研究。Kviatkovski等[9]设计的传感器以PMT光电探测器捕捉由PA产生的2-氨基苯乙酮(2-AA)激活感应元件而发出的波长490 nm的蓝光,通过与光电倍增管的结合实现对2-AA的检测。在实际样本检验中,通过收集外耳炎患者的耳中脓液样本,该装置能在2 nmol的水平上检测到2-AA。因此得出挥发性2-AA可作为耳部感染PA的有效生物标记物。

4.1.3 以培养环境的变化为分析目标 电阻抗法也是近几年发展起来的一种新型微生物快速检测技术。Chabowski等[57]采用电阻抗法检测PA,其设计的阻抗传感器具体原理为当PA在培养基内生长繁殖时,PA的新陈代谢作用导致培养基内营养成分发生变化,随之会导致培养基中的电导性和电阻抗能力发生改变,根据这种变化建模，从而通过测量这种PA变化幅度进行检测。

4.2 色谱法

以色谱法对PA代谢物的分析也主要是围绕PYO展开的。Fernandez等[58]以HPLC方法分析了PA的3种代谢物,包括1-羟基吩嗪(一种绿脓菌素降解物)和吩嗪-1-羧酸。该方法以PA菌液上清液为样本,以C18柱分析可以在32.4 min处检测到PYO出峰;董卉[59]建立了反向HPLC法,以乙酸乙酯萃取发酵液,以乙酸铵-乙腈作为流动相,在保留时间8.171～8.227 min内实现了对PYO的检测,并实现与其他吩嗪类化合物的有效分离,PYO的最低检出限达0.262 μg/mL;Reszka等[60]进一步建立了LC-MS方法分析PYO。该方法采用Waters Xbridge C18色谱柱分离,以甲酸-乙腈为流动相,保留时间3.69 min处出峰,5 kV喷雾电压,275 ℃毛细管温度完成PYO检测。Hamerly等[61]采用LC-MS分析PAO1代谢产物,并首次应用MALDI-IMS质谱成像技术对人工模拟被PA感染小鼠热损伤组织中化合物进行分析,确定铜绿假单胞菌和感染组织特有的代谢特征生物标志物,成功实现了原位检测组织中PA。

5 以全细胞为分析目标的检验技术

与动物细胞和植物细胞相比,PA的单个细胞相对较小,因此适用于PA全细胞检测的研究方法相对较少。为了实现对PA的分离鉴定,目前收集到的分析方法主要有以下三种:采用流式细胞术对单个菌体染色后分析、选择与PA细胞结合率高的适体,分析适体结合后生成的光电信号或采用拉曼光谱对含PA生物量较多的单菌落进行分析。

流式细胞术基于荧光激活细胞法,使细菌准确迅速的进入标准的96或384孔板,然后将被荧光色素染色的测量菌体用高能量激光照射,通过观察在高速流动状态下的菌体产生的散射光和发射荧光的强度和波长变化,从而实现对不同菌株的定性或定量检测。Chakotiya等[67]为研究生姜对PA活力的影响,利用荧光染料碘化丙啶(PI)的膜渗透能力,实现了用流式细胞术对完整PA和细胞膜破损PA的区分。Rüger等[68]将qT-RFLP与流式细胞术相结合,用免疫荧光单克隆抗体标记洋葱伯克霍尔德菌,以麦胚凝集素标记金黄色葡萄球菌,同时利用碘化丙啶PI标记细胞膜破损的死菌,以SYBRGreen I能选择性地标记双链DNA的特点,实现区分共培养的PA、洋葱伯克霍尔德菌和金黄色葡萄球菌3种菌,并能动态监测3种菌的死菌和活菌的比例。

核酸适体是一种几乎能与抗体相媲美的单链核酸分子,它是由SELEX技术筛选出来的能与靶分子特异性结合的DNA或RNA,并且其适用的靶分子范围广泛,不仅局限于核酸、抗体、金属离子,甚至可以和细胞体特异性结合[69]。Kim等[70]分别采用量子点和异硫氰酸荧光素FITC标记适体生物探针,利用适体与PA菌体结合时产生的荧光信号的变化来确定水中PA的污染程度。实验结果表明,与QD标记的适体相比,FITC标记的适体与菌体结合能力更高。最适孵育时间为30 min,检出限达5.07 cell/mL。Shi等[71]以磁珠/适体/多聚腺苷DNA为一体的“三明治结构”实现了对PA的选择性结合。当样品中存在PA时,由于适体对PA的特异性吸附,“三明治结构”中的多聚腺苷DNA会被PA取代。被释放的多聚腺苷DNA遇到纳米金粒子时会产生特殊的传感信号,通过对信号的分析从而间接实现对PA的检测。该方法在缓冲液中检出限可达9 CFU/mL,模拟血样中为52 CFU/mL。

6 结论与展望

在医学界,对耐药性铜绿假单胞菌的检验是主要关注点,但在环境领域和食品化妆品检验领域,如何能即时、快速、简单、准确地完成实验,以达到监测监管领域对检验时效的要求,则是研究者对检验方法的终极追求。

本文主要对近几年应用于不同领域的PA检验方法进行了综述。对于PA检验而言,分子生物学方法、蛋白免疫方法,几大类仪器分析检测手段几乎都已经可以实现各类样品的定性检验,但是以质谱色谱技术为基础的检验技术仪器成本相对较高,生物传感器类检验方法在灵敏度方面略显不足,但随着与各种新技术的组合优化过程,相信各类生物传感器在与磁珠富集法的组合后,便携简单快速的生物传感检测法会具有很好的应用前景;在定量检验方面,传统方法以及发展较早的分子生物学方法、免疫学方法依然具有很明显的优势。就样本类型而言,环境样本和医学样本相对简单,而食品类样本具有液态、固体、凝胶等多种状态,这种特性常会对分离和确认产生干扰,因而实现快速定量检测食源性微生物比临床上诊断和环境样品检测面临更多的挑战。Karami等[72]的研究表明,环境中分离出的和临床分离株在传播方面显著相关。环境中检出的PA也有耐药性,这说明在环境和食品领域中的PA检测需要更多的重视,尤其应多关注建立适合的检测耐药性PA的方法。

随着时代的高度发展,新技术、新仪器不断涌现,各种检验技术融合度也不断提高,单纯地使用任何一种方法都无法满足多方面的要求。目前新型的检验方法多是在基础的检验方法上改进了前处理方法或改变了数据收集方式,再或者是在各种技术融合应用的基础上开发的新方法,已经很难定义某项研究具体属于哪类检验领域。但层出不穷的检验方法也存在缺乏相关产品标准和质量标准以衡量具体方法有效性、适用性的问题,因而将现行前沿技术应用于实际检验中还有很长的路要走。在研究者不断的探索与创新中,PA的检验才能不再受时间、地点、操作人员等条件的限制,才能实现高效检测,由此才能实现最大程度地降低PA对人类身体健康带来的危害。