色谱及其联用技术在保健食品非法添加药物检测中的应用研究进展

项昭保,2,伍晓玲3,汪程远,2,李承霖

(1.重庆工商大学环境与资源学院,重庆 400067;2.天然药物研究重庆高校市级重点实验室,重庆 400067;3.重庆工商大学评估与督导办公室,重庆 400067)

随着社会经济的不断发展,人民生活质量不断提高,“治未病”的大健康理念越来越深入人心。保健食品含有一定量的功效成分,能调节人体的机能,具有特定的功效,是人体机理调节剂、营养补充剂,有助于人体健康;同时保健食品属于食品,食用安全。基于保健食品的功能性和安全性两大特点,越来越多的人选购、食用保健食品,使得我国保健食品行业取得了快速发展。

但是保健食品不是药品,它不以治疗疾病为目的,仅仅具有调节机体功能,因此服用保健食品起效较慢,效果不明显。在社会节奏越来越快的今天,人们越来越追求高效、快捷,对保健食品期望起效快、效果好。为满足这种需求，增强保健食品的保健功能,一些利欲熏心的生产厂家往往在保健食品生产过程中违法添加化学药物;一旦违法添加化学药物以后,与市场上其他同类产品相比,短期内即可收到立竿见影的效果,从而迅速占领市场,因此保健食品非法添加化学药物已成为当前保健食品造假的主要方式[1-2]。但是药物进入食物,对食品安全性造成严重影响,对人民群众生命安全造成了极大危害。

因此,保健食品非法添加化学药物属于食品药品监管部门严厉打击的对象。但是只有加强对保健食品中非法添加药物的检测,不断规范和改进检测技术,才能有效预防保健食品非法添加药物的危害。对保健食品中非法添加药物的检测中,如何在成分复杂的保健食品中迅速发现非法添加药物是关键。色谱技术是分离复杂混合物组分最有效的方法,在混合物分离纯化中广泛应用,配以合适的检测手段,广泛用于化学成分的定性定量分析。本文综述了近年来色谱及其联用技术在保健食品中非法添加药物检测中的应用,并进行了相应的归纳和分析,为保健食品中非法添加药物检测技术的进一步发展提供了参考,为保健食品生产销售管理的进一步规范提供了依据。

1 薄层色谱法(TLC)及其联用技术

1.1 薄层色谱法(TLC)

TLC操作简单,无需复杂的仪器和设备,尤其对于基层药品检验机构,可作为初筛保健食品中非法添加某些化学药物的有效手段。李惠敏[3]用乙醇提取待测品,提取液用硅胶GF254薄层板展开,以乙酸乙酯-二氯甲烷-冰醋酸(25∶25∶0.2)为展开剂,建立了双氯芬酸钠、对乙酰氨基酚、吲哚美辛和萘普生等4种解热镇痛类的TLC定性分析方法,该方法操作简单、分析速度快,同时具有良好的耐用性,并能同时分析多品种、多剂型、多规格的样品,可满足基层监管部门现场监管的需求。吴静[4]分别取镇静安神类中成药及保健食品一次服用量样品经三氯甲烷提取后点于硅胶GF254薄层板上,以正己烷-氯仿-甲醇(5∶3∶1)为展开剂,地西泮,苯巴比妥和艾司唑仑三种化学成分能得到较好的分离。刘若冰等[5]采用TLC对10个市售减肥保健食品进行非法添加盐酸西布曲明的定性鉴别,有8个检出了盐酸西布曲明,试验方法简便、快速,结果可靠。袁莉[6]采用TLC对11个润肠通便类保健品中大黄予以鉴别,可快速、准确的判断出润肠通便类保健品中是否非法添加大黄。

TLC方法简单、快速且重现性好,但定性能力有限,一般只能作为初筛手段,且易出现“假阳性”结果,而保健食品成分复杂,不同成分可能出现相同的比移值。因此,TLC必需有对照品且多次试验才能确定待测样品中是否含有非法添加的化学药品,或者借助其他技术手段进一步确定。

1.2 薄层色谱法与紫外联用技术(TLC-UV)

有些物质在紫外下会产生吸收光谱,利用物质分子紫外吸收所产生的紫外光谱及吸收程度可以对物质的含量和结构进行鉴定、分析。王蔼英等[7]取相当于一次口服剂量的唐得康胶囊、糖舒宁胶囊、清脂降糖胶囊、天葛胶囊内容物,分别加入三氯甲烷超声萃取,萃取液采用硅胶GF254薄层板,三氯甲烷-石油醚-甲醇-冰乙酸(8∶13∶1∶1)为展开剂,展开取薄层斑点,测其紫外吸收曲线,发现唐得康胶囊、糖舒宁胶囊、清脂降糖胶囊中非法添加了格列本脲,该方法简便易行、专属性较强,可用TLC-UV法对保健食品中掺入的化学降糖药物进行快速检测。余兰等[8]采用TLC-UV法对15个市售减肥保健食品进行非法添加盐酸西布曲明的定性鉴别,有8个检出了盐酸西布曲明,试验方法简便、快速,结果可靠。经TLC分离的样品通过UV测试进一步定性分析,比单纯的TLC定性能力强,但是物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征,并非整个分子的特征。而且很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收,因此利用UV鉴定有机化合物不如利用红外光谱(IR)有效。

1.3 薄层色谱法与傅立叶变换红外光谱联用技术(TLC-FTIR)

红外吸收峰的位置与强度反映了分子结构上的特点,可以用来鉴别未知物的结构组成或确定其化学基团,在未知化合物的结构鉴定上应用广泛[9]。许凤等[10]取10个减肥保健食品,用乙醇超声提取,固定相为GF254铝合金硅胶板,展开剂为乙酸乙酯∶石油醚(60～90 ℃)∶甲醇=10∶6∶1,分别用紫外灯(254 nm)和自制的2% NaOH试纸两种检视方法初筛,再利用TLC技术将可疑斑点分离纯化后进行FTIR检测,并与对照品的FTIR谱图比较确认。所建立的方法准确、可靠,可作为该类产品是否添加酚酞的检测方法。FTIR法对样品纯度要求较高,需要一套有效的分离技术。TLC法本身就是一种良好的分离技术,二者有效结合,对疑似含有非法添加化学药品的保健食品进行初筛的基础上,将目标化合物用TLC法分离制备后进行FTIR检测,并与对照品的红外光谱图进行比较,利用FTIR的定性、检索功能,能够快速准确地判断出保健品中是否含有非法添加化学药品。对于非法添加的化学药物成分明确的保健食品检测,TLC-FTIR联用技术有良好的应用。

FTIR加一个显微镜就可进行显微红外光谱分析(Micro-FTIR),其特点为灵敏度高,可以实现痕量样品的分析;不需要添加任何稀释剂,能反映样品的本质光谱;官能团的空间分布,Micro-FTIR能够给出吸收峰的图像,根据特征吸收峰在样品中的分布,判断官能团的空间分布,有利于结构分析。许凤等[11]取9个减肥保健食品,用甲醇超声提取,以硅胶GF254铝合金薄层板为固定相,以三氧甲烷-甲醇-氨水(11∶1∶0.12)为展开剂,用TLC快速初筛后,再联用Micro-FTIR对其进行定性检测。在检查下的9批供试品中有2批含有盐酸芬氟拉明,方法专属性强、灵敏度高、重现性好,可以作为该类保健食品非法添加盐酸芬氟拉明的快速检测方法。但是化合物有些基团振动时偶极矩没有变化,不出现红外吸收峰,无法据此进行结构鉴别。

1.4 薄层色谱法与拉曼光谱联用技术(TLC-Raman)

红外光谱和拉曼光谱都属于分子振动光谱,都是研究分子结构的有力手段,但红外光谱和拉曼光谱的选律不相同,有些基团振动时偶极矩变化非常大,红外吸收峰很强,是红外活性;有些基团振动时偶极矩没有变化,不出现红外吸收峰,属红外非活性,这种偶极矩没有变化的振动拉曼峰会非常强,属于拉曼活性。因此,IR和Roman总体上互补,拉曼活性振动,适合用拉曼光谱进行结构分析。李想等[12]建立TLC-Raman联用方法,并对减肥类保健食品中非法添加的四种化学成分(茶碱、咖啡因、苯丙酸诺龙、螺内酯)进行检测。采用TLC法将掺杂成分与保健食品基质进行初步分离,在紫外灯下检视定位,以780 nm激光为光源,对TLC上微量掺杂成分的斑点原位,直接检测浓集点的拉曼光谱。考察不同配方保健食品基质对掺杂成分拉曼光谱的影响,并对检测限进行验证,初步建立了减肥类保健食品中四种掺杂成分的TLC-Roman检测方法。而且常用保健食品基质对掺杂成分检测结果无干扰,不需要刮板。该法专属、灵敏、快速、简便,可为保健食品中非法添加化学成分的快速检测技术研究提供新的参考依据。

基于TLC-Raman联用技术,许凤等[13]对降压类保健食品中非法添加的3种化学成分(尼莫地乎、拉西地平和尼群地平)进行原位富集检测,并对6种降压保健食品进行了测试,TLC法采用硅胶60F254铝合金薄层板为固定相,环己烷-乙酸乙酯(体积比5∶4)混合溶液为展开剂,在紫外灯下检视定位,使添加成分与保健食品基质进行初步分离;再对薄层板上微量添加成分斑点用丙酮原位富集,直接检测富集斑点的显微拉曼光谱,结果表明,常用降压类保健食品基质对添加成分检测结果无干扰,显微拉曼光谱技术更易于直接获得大量有价值信息,共聚焦显微拉曼光谱不仅具有常规拉曼光谱的特点,还有自己的独特优势,具有微观、原位、多相态、稳定性好、空间分辨率高等特点。该法准确、灵敏、简便、快速,为保健食品中非法添加化学成分的快速检测提供了新的手段,是TLC-FTIR检测技术的有效补充,而且因为Raman光谱出现晚,更有新意。

2 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)

气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定,其具有GC的高分辨率和MS的高灵敏度,是复杂样品组分定性定量分析的有效工具。李涛等[14]采用溶剂超声或液-液萃取方式对样品进行提取富集,采用GC-MS检测降压类中成药及保健食品中非法添加化学药物,在30～60 min内快速检测降压类中成药及保健食品中是否非法添加尼群地平等7种化学药物,并在2批样品中分别检出了尼群地平和可乐定,该法快速、准确,专属性强,可用于快速打假中的检测。肖丽和等[15]用甲醇提取样品,采用全扫描一级质谱,并结合谱库检索进行定性鉴别;采用二级选择反应检测(MRM)方式进行定量分析,建立了镇静安神类中成药及保健食品中非法添加艾司唑仑的GC-MS/MS检测方法,该方法快速、灵敏、准确,可用于中成药及保健食品中非法添加艾司唑仑的检测方法。

GC-MS联用分析的灵敏度高,有强大的数据库检索功能,方便对可疑色谱峰的初步判断。虽然标准质谱库有助于定性,但也并非完全可靠;在初筛阳性后,需要使用对照品或其他方式辅助定性。此外GC-MS对部分药物的分析需要进行衍生化,耗时较长。因此GC-MS主要适用于低分子化合物(分子量<1000)分析,尤其适合于挥发性成分的分析。很多大分子或难气化的化学药物难以进行GC-MS分析。

3 高效液相色谱(HPLC)及其联用技术

3.1 高效液相色谱(HPLC)

由高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现的HPLC技术,具有高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广的特点[16],特别是近年来采用了二极管阵列检测器(DAD),提高了识别添加化学成分的科学性与准确性。邢俊波等[17]采用梯度洗脱,建立了同时分析测定补肾壮阳类中成药及保健食品中非法添加7种西药成分(豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、红地那非、伐地那非、伪伐地那非、他达那非、氨基他达那非)的高效液相色谱法。该方法简便快速准确,重复性好,适用于基层药检机构,可作为补肾壮阳类中成药及保健食品中非法添加上述7种西药成分的快速筛查方法。韩东岐等[18]采用梯度洗脱,建立了高效液相色谱-二极管阵列检测技术(HPLC-DAD)同时检测镇静安神类中成药及保健食品中非法添加的9种安眠药物。颜伟华等[19]采用梯度洗脱,HPLC-DAD技术,建立抗疲劳类保健食品中那红地那非、红地那非、伐地那非等12种化药成分的液相快速筛查方法。邓鸣等[20]采用等度洗脱,建立了在同一色谱系统检测中成药及保健食品中非法添加9种调血脂类药物成分的高效液相色谱快速检验方法。罗达龙等[21]建立了对3种不同剂型的保健食品样品中17 种非法添加化学物的同时分析高效液相色谱法。

3.2 高效液相色谱与固相萃取联用技术(HPLC-SPE)

色谱技术是分离纯化手段,样品成分越简单,色谱分析越容易。因此若配以良好的预处理技术,后期的分析检测简单高效。固相萃取(Solid-Phase Extraction,简称SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术,由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来,主要用于样品的分离、纯化和浓缩,与传统的液液萃取法相比可以提高分析物的回收率,更有效的将分析物与干扰组分分离,简化样品预处理过程,是复杂样品进行仪器分析最广泛应用的前处理技术[22]。多壁碳纳米管分散型固相萃取(MWCNTs-dSPE)[23]与传统固相萃取SPE相比,分散型固相萃取(dSPE)无需填充柱子和严格控制上样及洗脱过程,直接将吸附材料加入含有目标分析对象的样品提取液中,在杂质吸附模式下,吸附材料保留样品中的杂质,从而实现样品基质的净化[24]。黄佳佳等[25]建立MWCNTs-dSPE-HPLC法测定降糖类保健食品中非法添加物罗格列酮的检测方法。该样品前处理方法简便、快速且成本较低,适用于批量保健食品中罗格列酮的快速检测。

表1 保健食品中非法添加HPLC-MS检测方法Table 1 HPLC-MS methods for the determination of illegal addition in health food

HPLC法简便、快速、准确、重复性好,适用于基层药检机构检测非法添加药物,但需要对照品,由于保健食品非法添加化学药物的不确定性,同时又缺少广谱筛查方法,尚难以定性与筛查未知药物,检测保健食品非法添加化学药物任重道远。

3.3 高效液相-质谱联用技术(HPLC-MS)

HPLC技术具有高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广的特点,但需要对照品才能定性,进而进一步定量分析。保健食品中非法添加的化学成分一般未知,生产企业也会选择尚未被监测的化学成分添加。因此HPLC技术对保健食品复杂的化学成分高效分离后,尚需与能确定化学成分化学结构的技术联用,才能对非法添加的未知成分进行快速定性定量分析。MS技术是目前单独确定化合物结构的有效方法,HPLC-MS联用技术既能对复杂成分进行快速分离,也能对具体成分进行结构分析,所以被越来越多地用于保健食品中非法添加化学药物的检测分析[26],表1作小结如下。MS分析的离子源一般都是ESI,质量分析器主要是三重四级杆和离子肼。色谱分离条件依保健食品具体成分而定,以梯度洗脱方式居多。

4 超高效液相色谱(UPLC)及其联用技术

HPLC技术虽具有高速、高效、高灵敏度的特点,但保健食品成分很复杂,色谱分析时长一般均在40 min以上,有些色谱分析甚至超过60 min,耗时长。而超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)借助于高效液相色谱法的理论和原理,涵盖了小颗粒填料、小系统体积(死体积)及快速检测手段等全新技术[35-36],具有超高分离度、超高速度、超高柱效、高灵敏度等优势,与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9、3、1.7倍,目前在分析实验室中的运用越来越普及,在保健品中非法添加化学药物检测的应用越来越广泛[37]。

4.1 超高效液相色谱(UPLC)

程燕等[38]采用梯度洗脱,建立了超高效液相色谱同时测定功能性饮品和抗疲劳类保健食品中非法添加的11种化学药物。该法具有较好的专属性、线性、回收率和精密度,在10 min内可实现11种化学药物的分离,适用于抗疲劳类保健食品中非法添加的11种化学药物的同时快速测定。王静文等[39]采用梯度洗脱,建立了超高效液相色谱同时测定减肥类保健食品中非法添加的25种药物的方法。该法在26 min内可实现25种化学药物的分离,与传统液相色谱方法相比,可在保证分离度的情况下,实现快速有效的高通量分析,且检测的化合物种类较全面,可为监测保健食品非法添加药物提供强有力的技术支持。

4.2 超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)

UPLC与传统的HPLC相比,分离速度、灵敏度及分离度均有明显增加[47-48]。但需要新增设备及配套的实验场地,所需成本较高。实心核颗粒色谱技术是近几年开发的色谱填充新技术,该技术优化了高效液相色谱仪运行背压,通过提高分离度以及峰容量实现了普通高效液相色谱仪分离效率的最大化,使得分析效率能媲美超高效液相色谱,而且通用性和普及性更强。励炯等[49]以高色谱性能的实心核颗粒色谱柱,建立了降糖类保健食品中非法添加13种化学成分的定性定量检测方法,简捷快速(只需10 min即可完成检测),灵敏度高,抗干扰能力强,可满足实际样品检测的需要,特别涉及需要尽快报告结果的检测时,效果很好。

5 色谱与其他技术三种联用

为进一步确保结果的准确性,也有综合了色谱技术与其他技术共3种技术联用,用于保健食品中非法添加化学成分的检测,如田国贺等[50]运用近红外光谱(NIR)法对降糖类中药及保健食品中非法添加盐酸二甲双胍进行快速筛选,采用逆向思维方法,以盐酸二甲双胍对照品NIR图谱作为参照光谱,与降糖药NIR光谱比对,建立对照品与中药制剂及保健食品的相关系数,快速筛查中成药及保健食品中是否非法添加了盐酸二甲双胍,经HPLC-MS联用定性后,将法定检验结果与NIR结合,建立 NIR检验模型,建立的应急模型具有方法简单、快速、易操作等特点,适用于大量样品的快速筛选。廖春玲等[51]优化梯度洗脱条件,UPLC在12 min后便可分离18种药物,并均保持良好峰形。提取样品后先用UPLC将样品中可疑色谱峰筛查出来,再用 GC-MS法进行确证,时间约为23 min,采用UPLC 和GC-MS法联合检测安神类保健食品新型非法添加药物,操作简单、快速且可靠。Zhang等[52]利用SPE技术进行前处理,建立了SPE-UPLC-MS方法检测了广东凉茶中非法添加阿司匹林、对乙酰氨基酚、氯曲美酮、双氯芬酸、头孢拉定、头孢氨苄、头孢唑啉和齐特霉素等8个化学药物,在36份广东凉茶样品中发现在4份样本中非法添加对乙酰氨基酚、氯曲美酮和阿司匹林3种化学药品,该方法具有良好的线性关系、选择性、准确性、日内精度和日间精度。

6 结论与展望

近年来,保健食品非法添加化学药物现象已受到广泛重视,非法添加检测技术研究和应用取得了一定的进展,国家食品药品监督管理总局先后陆续批复了多个保健食品非法添加化学药品检测检验方法,如保健食品中75种非法添加化学药物的检测(BJS 201710)。保健食品中违法添加化学药物的检测方向正向便捷、快速、高选择性等方向发展,集高效分离技术和检测技术于一体的联用技术,如HPLC-MS技术越来越常用,但由于保健食品成分非常复杂,同时非法添加具有很大的不确定性,又缺少广谱筛查方法,对其非法添加化学药物的检测还存在一些问题:

第一,检测方法的针对性与化学药物添加的随意性难以协调。现有国家食品药品监督管理总局批复的保健食品非法添加化学药品检测方法,大多是根据少数在监管标准内添加的药物建立,而对于未知添加药物无法筛查;基层检测单位仅仅根据相应方法对待测保健食品中某些特定的添加药物进行筛查,做出是否添加相应药物的结论,并不能对保健食品的安全性做出全面系统的判定,事实上不少经基层食品检验单位鉴定合格的保健食品,仍然含有其他有害身体健康的化学药物未被检测出。

第二,广谱筛查方法的缺失。现有检测方法主要是基于目标筛查的模式建立,只能针对具体已知的非法添加药物进行针对性评估,对于未知物质的筛查、定性定量分析则无能为力。很多不法厂商正是利用这一漏洞,非法添加现行检测方法检测目标物之外的相关药物,谋取暴利,短期内非法添加的药物却不会被检测,自然不会被查出。因此,检测食品非法添加药物任重道远,未来需加大研发力度,在技术上开发与研究广谱筛查方法,保障消费者的权益。

第三,加快制定检测技术标准和推广力度。当前对非法添加药物的检测技术研究越来越多,但能上升为技术标准,并推广应用的少之又少。监管部门组织相关科研机构加快制定有效、广谱的检测技术标准,并尽快推广应用,重点应集中在具有智能性、预警性和及时性等特点的技术标准,同时加快建设非法添加药物阳性数据库、数据源,并加快实现这些数据库、数据源在全国范围内的共享。可以借鉴相关经验[53-55],尝试建立政府、企业之外的第三方认证平台,监测保健食品的品质。

总之,保健食品非法添加化学药物检测技术研究越来越多,色谱法具有良好的分离能力,结合相应的检识方法,理论上均能对非法添加药物进行检测。当前的重点是尽快建立便捷、快速、高通量的检测方法,并形成相应的技术标准,适合在基层食品检验单位推广应用,有效控制保健品质量，打击保健品行业非法添加行为，保障消费者的权益。