细胞自噬调节上皮细胞间充质转化过程对特发性肺纤维化的作用机制

苗 双，丁国建，宋殿芳，张传厚，刘乃国，董洪亮

0 引 言

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种间质性肺疾病，病死率高，发病率逐年升高，IPF 确切的发病机制尚不明确［1-5］。Chitra 等［6］发现，在大鼠IPF 肺组织中Beclin1、LC3-Ⅱ的mRNA及蛋白水均显著低于正常对照，且电镜下也很少发现有自噬小体形成。Patel 等［7］发现，IPF 患者的肺组织中LC3-Ⅱ、Atg5 的蛋白水均与正常组织相比显著降低。由此可见，在IPF 的发生发展过程中，自噬明显缺陷或并未被诱导激活。研究报道发现，Rapamycin可以通过抑制mTOR通路来诱导细胞自噬，进而延缓小鼠IPF 中纤维化的发病进程［8］。因而，诱导或抑制细胞自噬可以阻碍或促进机体组织或细胞的纤维化进程。近年来报道显示，TGF-β 介导的EMT 过程在IPF 发生发展过程中起重要作用［9］；抑制HSP27 的表达可以通过下调转录因子Snail 来阻碍EMT 过程，从而达到抑制IPF 的效果［10］；miR221注射到博来霉素诱导的肺纤维化小鼠体内，通过下调HMGA2 的表达，抑制EMT 过程进而抑制IPF 进程［11］。综上所述，肺泡上皮细胞的反复的损伤-修复过程，是引起肺纤维化的关键过程，EMT 过程在IPF的发生发展过程中其重要作用，抑制EMT 过程可抑制IPF 的进程。细胞自噬与EMT 的相互关系，以及两者在疾病发生机制中作用已引起许多研究者的关注，研究发现肿瘤细胞中自噬激活可以通过抑制Wnt 通路，来参与细胞的EMT 过程［12］。Grassi 等［13］发现，在人的肝上皮细胞中，诱导自噬可以抑制TGF-β 引起的细胞的EMT 过程。细胞自噬及上皮细胞间充质转化过程（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与IPF 的发生发展、治疗过程均有密切关系［14-15］。因此，本研究旨在探讨细胞自噬对上皮细胞的EMT 过程的调控作用，并阐明此过程对IPF 的发生发展的作用及机制。以期进一步揭示IPF 的发病机制，为IPF治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料A549细胞购于ATCC细胞库。DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购于Hyclone 公司。青霉素链霉素溶液、胎牛血清购于Gibco 公司。HiFiScript Qµick gDNA Removal cDNA Kit、Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix购于康为世纪有限公司。α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Beclin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、E-cadherin、Vimentin、GAPDH 鼠抗人一抗购于美国abcom公司，HRP标记的羊抗鼠二抗工作液购于北京中杉金桥生物技术有限公司。羟脯氨酸检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。应用Primer（version5.0）软件分析设计特异性引物，并由上海生工技术有限公司合成。内参基因GAPDH的引物由上海生工技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 IPF细胞模型分组及处理用TGF-β1处理上皮细胞（A549）的方式构建IPF细胞模型。实验分为对照组、肺纤维化组、自噬诱导组、自噬抑制组。对照组细胞以普通的DMEM 培养基进行培养；肺纤维化组、自噬诱导组、自噬抑制组细胞培养过程中，在DMEM 中加入终浓度5 ng/mL 的TGF-β1 进行诱导，肺纤维化组不做进一步处理，自噬诱导组、自噬抑制组在此基础上分别加入终浓度10µg/L Rapamycin（RPM）、10 mmol/L 3-Methyladenine（3-MA）来诱导或抑制细胞自噬。实验选取12、24、48 h 进行相关检测及观察。羟脯氨酸含量检测：采用碱水解法，根据羟脯氨酸检测试剂盒的说明进行操作，检测各组样品羟脯氨酸的含量，每个重复3次，取平均值。

荧光定量PCR（Real-time PCR）：Trizol法分别提取上述各组细胞的总RNA，分光光度计检测RNA的浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用HiFiScript Qµick gDNA Removal cDNA Kit 进行反转录，合成cDNA 作为荧光定量检测模板。以GAPDH（GAPDH-F：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、GAPDH-R：5′-GAAGATGGTGATGGGATTT-3′）为内参基因，对α-SMA（α-SMA-F：5′-TTACGAGTTGCCTGATGG-3′、α-SMA-R：5′-TGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3′）、Beclin1（Beclin1-F：5′-ATGCAGGTGAGCTTCGTGTG-3′、Beclin1-R：5′-CTGGGCTGTGGTAAGTAATGGA-3′）、LC3-Ⅱ（LC3-II-F：TTCAGGTTCACAAAACCCGC、LC3-II - R：TCTCACACAGCCCGTTTACC）、Vimentin（Vimentin-F：5′-CTGAACCTGAGGGAAACTAA-3′、Vimentin-R：5′-AGAAAGGCACTTGAAAGCT-3′）、E-cadherin（Ecadherin-F：5′-CTGAGAACGAGGCTAACG-3′、Ecadherin-R：5′-GTCCACCATCATCATTCAA-3′）的mRNA 的转录水平进行相对定量。反应体系：2×Maxima SYBR Green Mix 12.5µL，Forward Primer 1µL，Reverse Primer 1µL，cDNA 模板1µL，RNasefree Water 补足至25µL。扩增反应条件：95 ℃5 min；变性95 ℃15 s、退火53 ℃20 s、延伸72 ℃20 s，35个循环。所得数据用2-△△CT法进行统计分析。

1.2.2 Western blot 检测选取24 h 时各组细胞，用RIPA 裂解液进行匀浆，离心收集上清作为样品。然后进行SDS-PAGE 凝胶电泳、转PVDF 膜、1%脱脂乳封闭、不同基因（α-SMA、Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、E-cadherin、Vimentin、GAPDH）鼠抗人一抗（1∶2000）孵育过夜，TBST 清洗3 次，每次5 min、羊抗鼠二抗（1∶2500）孵育45 min，TBST 清洗清洗3 次，每次5 min，化学发光试剂盒显色，Odyssey 双红外荧光成像系统进行成像和定量分析。

1.3 统计学分析采用SPSS 16.0 软件进行统计分析，定量资料以均值±标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 羟脯氨酸含量检测结果与对照组比较，肺纤维化组、自噬诱导组、自噬抑制组各时间点羟脯氨酸含量均明显升高（P＜0.05）。与肺纤维化组比较，自噬诱导组在各时间点羟脯氨酸降低（P＜0.05），自噬抑制组升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 Real-time PCR 检测结果与对照组比较，肺纤维化组、自噬诱导组、自噬抑制组各时间点α-SMA、Vimentin 的mRNA 转 录 水 均 升 高（P＜0.05），Beclin1、LC3-Ⅱ、E-cadherin 的mRNA 转 录 水 均 降 低（P＜0.05）。与肺纤维化组比较，自噬诱导组各时间点α-SMA、Vimentin 的mRNA 转录水均降低（P＜0.05），Beclin1、LC3-Ⅱ、E-cadherin 的mRNA 转录水均升高（P＜0.05）；而自噬抑制组各时间点α-SMA、Vimentin 的mRNA 转 录水均升高（P＜0.05），Beclin1、LC3-Ⅱ、E-cadherin 的mRNA 转录水均降低（P＜0.05）。见表1、表2。

2.3 Western blot 检测与对照组比较，肺纤维化组、自噬诱导组、自噬抑制组α-SMA、Vimentin 的蛋白表达水均明显升高（P＜0.05）；Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、E-cadherin的蛋白水均降低（P＜0.05）。

表1 各组α-SMA、Beclin1、羟脯氨酸的mRNA的相对表达量比较Table 1 α-SMA，Beclin1 and hydroxyproline expression levels in different groups

表1 各组α-SMA、Beclin1、羟脯氨酸的mRNA的相对表达量比较Table 1 α-SMA，Beclin1 and hydroxyproline expression levels in different groups

与对照组比较，*P＜0.05；与肺纤维化组比较，#P＜0.05

组别12 h α2-4S Mh A 48 h 12 h Be 2 cl 4 i nh1 48 h 12 h羟脯氨酸含24量 （hµg/106 Cel 4 l）8 h对照组0.99±0.021.00±0.010.98±0.01456±23474±25477±441.00±0.020.98±0.040.97±0.04肺纤维化组2.30±0.21*3.10±0.43*3.80±0.65*977±46*1143±41*1357±68*0.43±0.13*0.34±0.17*0.27±0.07*自噬诱导组1.67±0.21*#2.20±0.25*#3.00±0.23*#601±51*#812±60*#968±57*#0.75±0.11*#0.51±0.08*#0.43±0.06*#自噬抑制组2.89±0.32*#3.99±0.38*#4.35±0.51*#1211±61*#1719±96*#1806±84*#0.26±0.03*#0.20±0.03*#0.16±0.01*#

表2 各组Vimentin、E-cadherin、LC3-Ⅱ的mRNA的相对表达量Table 2 Vimentin,E-cadherin and LC3-ⅡmRNA expression levels in different groups

表2 各组Vimentin、E-cadherin、LC3-Ⅱ的mRNA的相对表达量Table 2 Vimentin,E-cadherin and LC3-ⅡmRNA expression levels in different groups

与对照组比较，*P＜0.05；与肺纤维化组比较，#P＜0.05

组别12 h Vim 24 e nht in 48 h12 h E-c 2 a 4 dh h erin 48 h12 h LC 24 3 -hⅡ48 h对照组0.98±0.030.99±0.021.01±0.020.98±0.030.97±0.040.99±0.010.99±0.010.99±0.021.00±0.02肺纤维化组2.53±0.63*3.88±0.81*5.70±0.49*0.40±0.02*0.21±0.01*0.17±0.010.38±0.05*0.21±0.03*0.15±0.01*自噬诱导组1.99±0.19*#2.87±0.27*#4.24±0.39*#0.57±0.02*#0.41±0.04*#0.27±0.01*#0.64±0.05*#0.40±0.04*#0.34±0.02*#自噬抑制组3.85±0.38*#5.41±0.54*#6.08±0.71*#0.21±0.02*#0.12±0.01*#0.10±0.01*#0.20±0.03*#0.08±0.01*#0.10±0.02*#

与肺纤维化组比较，自噬诱导组α-SMA、Vimentin 的 蛋 白 表 达 水 均 降 低（P＜0.05），Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、E-cadherin 的蛋白表达水均升高（P＜0.05）；自噬抑制组α-SMA、Vimentin 的蛋 白 表达 升高（P＜0.05），Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、E-cadherin 的蛋白表达降低（P＜0.05），见表3，图1。

图1 各组α-SMA、Beclin1、LC3-II/LC3-I、Vimentin、Ecadherin的蛋白表达比较Figure 1 α-SMA，Beclin1，LC3-II/LC3-I，Vimentin and Ecadherin protein expression in different groups

2.4 细胞形态变化24h 时，倒置显微镜观察细胞形态变化，显示对照组细胞无变化，为多边形。实验组各组细胞形态变化最为明显，由多边形向长梭形转变。且相同视野内长梭形细胞所占比例，自噬诱导组小于肺纤维化组，自噬抑制组大于肺纤维化组。见图2。

图2 显微镜观察各组细胞形态（×100）Figure 2 Microscopic images in different groups（×100）

表3 各组α-SMA、Beclin1、LC3-Ⅱ、Vimentin、E-cadherin的蛋白表达Table 3 α-SMA、Beclin1、LC3-Ⅱ、Vimentin and E-cadherin protein expression in different groups

表3 各组α-SMA、Beclin1、LC3-Ⅱ、Vimentin、E-cadherin的蛋白表达Table 3 α-SMA、Beclin1、LC3-Ⅱ、Vimentin and E-cadherin protein expression in different groups

与对照组比较，*P＜0.05；与肺纤维化组比较，#P＜0.05

组别 α-SMABeclin1LC3-ⅡVimentinE-cadherin对照组1.21±0.172.31±0.311.15±0.140.27±0.073.07±0.41肺纤维化组2.57±0.34*0.54±0.29*0.53±0.11*1.74±*0310.74±0.35*自噬诱导组1.69±0.31*#0.91±0.23*#0.76±0.09*#1.03±0.25*#1.21±0.51*#自噬抑制组3.41±0.52*#0.28±0.07*#0.17±0.08*#2.43±0.61*#0.35±0.07*#

3 讨 论

TGF-β1 处理上皮细胞（A549）构建IPF 的细胞模型，是目前研究中常用的建模方式［16］。我们的结果中，肺纤维化组羟脯氨酸含量及α-SMA 的mRNA转录水平和蛋白表达水均明显高于对照组，且倒置显微镜观察发现肺纤维化组的大部分细胞，随时间进程逐渐由多边形向长梭形转变。上述结果表明，我们成功构建了IPF细胞模型。

Beclin1 时自噬体形成过程中一个必要的分子，能够介导其它自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬过程中表达往往会上升［17］。自噬形成时，胞浆型LC3 会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为LC3-II，因此，LC3-II/LC3-I 比值的大小可估计自噬水平的高低［18］。本研究的肺纤维化组中，Beclin1、LC3-Ⅱ的转录及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水均明显低于对照组，表明IPF 中细胞自噬的确存在缺陷或被抑制。EMT 主要的特征有E-cadherin表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架等［19］。本研究中肺纤维化组与对照组比较中，Vimentin 的转录和表达水平明显升高，E-cadherin 的转录和表达水平明显降低，表明IPF中EMT过程确实被激活。上述结果证实了细胞自噬及EMT过程在IPF中起重要作用。

Rapamycin 是一种有效且特异性的mTOR 抑制剂，是常用的自噬激活剂［20］。3-Methyladenine 可以通过抑制class III PI3K，常作为自噬的抑制剂使用［21］。本研究在A549 细胞加入TGF-β1 诱导构建IPF 的细胞模型中选用Rapamycin、3-Methyladenine来分别诱导和抑制细胞自噬。结果显示自噬诱导组与肺纤维化组比较，各时间点Beclin1、LC3-Ⅱ的转录及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平明显升高，Vimentin 和E-cadherin 的转录及表达水平明显降低和升高，α-SMA 的mRNA 转录和表达水平及羟脯氨酸的含量均较肺纤维化组也出现了明显的降低，表明自噬诱导组中加入Rapamycin 后自噬被激活，进而抑制了EMT 过程，最终IPF 的发生与发展也受到了抑制。另外，自噬诱导组与对照组比较显示，各时间点Beclin1、LC3-Ⅱ的转录及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平明显降低，Vimentin和E-cadherin的转录及表达水平明显升高和降低，α-SMA 的mRNA转录和表达水平及羟脯氨酸的含量均较肺纤维化组也出现了明显的升高。这说明IPF 发生过程中，诱导自噬可以减弱EMT 进程，起到延缓IPF 进程的作用，但不足以阻止IPF 的发生。自噬抑制组与肺纤维化组比较，各时间点Beclin1、LC3-Ⅱ的转录及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平相比明显降低，Vimentin 和E-cadherin 的转录和表达水平分别出现了明显升高和降低，α-SMA 的转录和表达水平及羟脯氨酸的含量均现了明显升高，上述结果表明此组中加入3-Methyladenine，自噬被抑制后，EMT进程被激活，同时促进了IPF的发生与发展。

综上所述，细胞自噬和EMT 过程在IPF 中起重要作用。在IPF 中，诱导细胞自噬，可以抑制上皮细胞的EMT 进程，进而延缓肺纤维化进程的效果，但不足以阻止IPF 的发生；反之，抑制细胞自噬，可以激活上皮细胞的EMT 进程，最终加快IPF 的发病进程。本研究进一步揭示了IPF的发病机制，为IPF的治疗提供了依据。