癌易感性候选基因2通过NF-κB信号通路对甲状腺乳头状癌细胞增殖及迁移的影响

张 洁，孙国欣，戴 亮，马 煜，孙雅涵，王岚玉，田 炜，张国志，陈建立

0 引 言

癌易感性候选基因2（cancer susceptibility candidate2，CASC2）是一种长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），长度＞200 个核苷酸，与人类许多疾病的发生有重要关系［1-2］。如Huang 等［3］证明CASC2 在甲状腺癌中呈现低表达，其过表达可导致AKT 和ERK1/2 的失活从而起到抑制作用，Zhou 等［4］也证实过表达lncRNA CASC2 可通过影响细胞外调节蛋白激酶途径促进甲状腺乳头状癌细胞侵袭，但CASC2 与NF-κB 信号通路的关系国内外报道较少。NF-κB 为一组具有特殊DNA 结合序列的转录因子，参与细胞增殖和癌变等多种生物学过程［5-7］。丙二醇甲醚醋酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）可以结合并激活PKC 蛋白激酶系统导致一系列的蛋白应答反应。核因子NF-κB 调控细胞内部蛋白表达水平是PKC 信号通路蛋白的应答反应之一。本研究旨在探讨lncRNA CASC2a在甲状腺乳头状癌细胞TPC-1 中通过NF-κB 信号通路对TPC-1 增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1 购于美国细胞库（ATCC），细胞培养使用补充有10%胎牛血清（FBS；Gibco，China），1%含10 000 Units/mL 青霉素和10 000µg/mL 链霉素（Gibco，USA）的RPMI 1640（Gibco，China）并置于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中。

1.2 过表达质粒构建与转染lncRNA CASC2a过表达质粒pcDNA3.1（+）-CASC2a 购于上海中乔新舟公司。同批细胞传代培养至密度达70%～90%，随机分为质粒组［转染过表达质粒pcDNA3.1（+）-CASC2a］、空载组［转染等量pcDNA3.1（+）空载质粒］、空白组（未做任何处理），于转染前全部更换为基础1640 培养基，使用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（Thermo Fisher，USA）分别转染过表达质粒pcDNA3.1（+）-CASC2a 及等量pcDNA3.1（+）空载质粒，转染后6 h 更换为补充有血清和双抗的完全1640 培养基。每组实验至少重复3 次。

1.3 总RNA 的提取及RT-qPCR转染后24 h，采用RNA pure（ZOMANBIO，China）分别提取质粒组、空载组及空白组细胞的总RNA，使用分光光度计（Thermo Fisher，USA）检测RNA 的浓度及纯度。使用ABScriptⅡReverse Transcriptase（ABclonal，USA）将总RNA 逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，使用2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox Ⅱ（ABclonal，USA），以GADPH 为内参基因进行RT-qPCR，GADPH 引物序列：GADPH-F：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′，GADPH-R；5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGT-3′。CASC2a引物序列：CASC2（a/b）-F：5′-TACAGGACAGTCAGTGGTGGTA-3′，CASC2（a/b）-R：5′-ACATCTAGCTTAGGAATGTGGC-3′。通 过RT-qPCR 检测转染效率，比较3 组细胞lncRNA CASC2a 含量。结果以2-ΔΔCT表示并进行统计学分析。ΔΔCT计算公式如下：

1.4 PMA 刺激细胞选取同批次转染后质粒组的细胞，随机分为转染组［只转染过表达质粒pcDNA3.1（+）-CASC2a］、转染+PMA 组［转染过表达质粒pcDNA3.1（+）-CASC2a+PMA 刺激］、对照组（未做任何处理）、PMA组（只增加PMA刺激），给与1µmol/L刺激24h［8］。

1.5 CCK-8 检测细胞增殖能力选取同批次转染后生长状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后进行细胞计数，约1000 个细胞/孔，接种于96 孔板上，每组设置6 个复孔，在37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养24 h，使细胞完全贴壁，检测前更换新的完全培养基100µL/孔，并加入10µL/孔CCK-8，再次置于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱，每隔30 min 使用Multiskan FC 酶标仪（Thermo Fisher，USA）检测细胞在450 nm 波长处的吸光度，每组实验重复3次取平均值，分别检测24、48、72、96 h 的细胞增殖变化情况。

1.6 细胞划痕实验选取同批次转染生长状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后接种于6孔板中，每组设置3 个复孔（可于接种前使用marker 笔在6 孔板背面划横线标记），置于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养，待培养密度达100%后，用200µ移液枪枪头分别在培养孔内划痕，保证同一枪头，减少实验误差，划痕后使用PBS冲洗3次，更换为基础1640培养基，在显微镜下观察划痕愈合情况并拍照记录，然后置于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养，待培养48 h 后，再次在显微镜下观察划痕愈合情况并拍照记录，比较2 次结果。使用ImageJ 软件计算迁移区面积，每组实验重复3 次取平均值。迁移率计算公式如下：

1.7 Western blot 检测通路蛋白表达使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液（RIPA 裂解液∶蛋白酶抑制剂=250∶1）裂解质粒组、空载组、空白组细胞，超声震碎10 s，并使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量（碧云天，中国），加入2×上样缓冲液后100 ℃煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min 后，以220 mA 恒定电流湿转120 min，使蛋白质转移到PVDF 膜上，再用100 g/L 的脱脂牛奶室温封闭2 h。使膜与NF-κB 信号通路相关抗体anti-NFkappaB p105/p50、anti-NF-kappaB p65 的一抗孵育，4 ℃过夜。再将膜与特异性兔二抗在室温下孵育2 h，使用Genshare 超敏化学发光底物检测试剂盒（晶彩生物，中国）来开发蛋白质条带，并使用ImageJ 软件量化条带的强度。其中内参选用β-tubulin。同样方法，再次检测转染组、转染+PMA 组、对照组、PMA 组细胞的NF-κB 信号通路相关抗体p105/p50、p65 的表达，并与之前结果进行比较。每组实验重复3 次取平均值。蛋白相对表达量计算公式如下：

1.8 统计学分析采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两独立样本均数比较用t 检验，多组之间均数比较采用重复测量方差分析。以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 过 表 达 lncRNA CASC2a 对 TPC-1 中CASC2a 表达的影响转染过表达质粒pcDNA3.1（+）-CASC2a 后，质粒组细胞中CASC2a 的表达量（2851.85±971.68）明显高于空载组（1.00±0.00），差异有统计学意义（P＜0.05），说明转染成功。

2.2 过表达lncRNA CASC2a 加NF-κB 信号通路激动剂PMA 对TPC-1 细胞增殖及迁移能力的影响对照组、转染组、转染+PMA 组组内不同时间点的差异有统计学意义（P＜0.000），PMA组24 h与48 h间差异无统计学意义（P=0.183），其余各时间点间差异有统计学意义（P＜0.000）。转染组24 h、48 h、96 h 细胞增殖能力低于对照组（P＜0.01），说明提高lncRNA CASC2a 水平后可抑制细胞增殖。转染+PMA组24 h 的细胞增殖能力低于转染组（P＜0.01），说明过表达lncRNA CASC2a 后通过NF-κB 信号通路来抑制细胞增殖。见表1。转染+PMA 组的细胞迁移能 力［（0.208±0.109）%］低 于 转 染 组［（1.775±0.061）%］、PMA 组［（1.622±0.519）%］、对 照 组［（2.927±0.136）%］，转染组、PMA组低于对照组（P＜0.05）。见图1。

2.3 过表达 lncRNA CASC2a 对抗体蛋白p105/p50、p65 的表达Weatern blot 检测结果显示，质粒组p105/p50、p65 蛋白相对表达量明显低于空白组（P＜0.05），说明在转染lncRNA CASC2a 后，可以抑制NF-κB 信号通路相关抗体蛋白p105/p50、p65 的表达，从而起到抑制NF-κB 信号通路的作用。转染+PMA 组p105/p50、p 65 蛋白表达量较转染组增加（P＜0.05）。说明过表达lncRNA casc2a 可通过NF-κB 信号通路来抑制细胞的增殖和迁移。见表2，图2。

表1 各组细胞不同时间点细胞增殖能力的比较()Table 1 Comparison of cell proliferation in each group()

表1 各组细胞不同时间点细胞增殖能力的比较()Table 1 Comparison of cell proliferation in each group()

与对照组比较，*P＜0.05；与PMA 组比较，#P＜0.05；与转染组比较，△P＜0.05

组别A450值24 h48 h72 h96 h对照组0.260±0.0040.428±0.0260.758±0.0061.330±0.036 PMA组0.247±0.0090.387±0.0260.792±0.0841.230±0.108*转染组0.217±0.013*#0.339±0.006*#0.723±0.017#1.151±0.037*#转染+PMA组0.191±0.005*#△0.315±0.008#0.647±0.041#0.974±0.018#

表2 各组P105/p50、p65蛋白相对表达量()Table 2 Relative expression levels of P105 and p65 proteins in each group()

表2 各组P105/p50、p65蛋白相对表达量()Table 2 Relative expression levels of P105 and p65 proteins in each group()

与对照组比较，*P＜0.05；与PMA 组比较，#P＜0.05；与转染组比较，△P＜0.05；与空白组比较，☆P＜0.05

组别p105/p50p65对照组0.763±0.0080.886±0.074 PMA组0.932±0.029*0.869±0.048转染组0.581±0.003*#0.570±0.012*#转染+PMA组0.674±0.007*#△0.713±0.014*#△空白组1.558±0.5412.538±0.170空载组0.765±0.020☆0.871±0.178*质粒组0.979±0.096☆1.001±0.034*

图1 不同时间各组细胞迁移情况Figure 1 Cell migration in each group

图2 各组蛋白相对表达量比较Figure 2 Comparison of protein relative expression in blank group，control group and experimental group

3 讨 论

迄今为止，lncRNA 的相关研究还处于基础阶段，研究揭示了lncRNA 通过与蛋白质、RNA 和脂质相互作用在癌症发生发展中起关键介质作用［9］。甚至有些lncRNA 在癌症中可通过调节p53、NF-κB 等重要的转录因子来进行转录调控［10］。lncRNA 在肿瘤研究中的重要作用逐渐显现［11-14］。LncRNA CASC2 通过可变性剪切形成3个转录变异体，分别为CASC2a、CASC2b、CASC2c［15-16］。与正常组织相比，肿瘤组织和细胞系中CASC2a 的mRNA 表达下降。CASC2a 存在于发生等位基因缺失的序列中，因其失活后会发生瘤变，所以CASC2a 有抑癌作用［15］。研究显示lncRNA CASC2a 可能通过调控PTEN/Akt、Wnt/βcatenin、MAPK 等多种信号通路蛋白，参与调控肿瘤的多种生物学行为，如增殖、侵袭和转移等［17］。故本研究拟在前人基础上选取CASC2a，研究其在甲状腺癌细胞中的抑癌作用。

NF-κB 作为一种重要的转录因子，参与机体多种反应和过程［18］。研究发现NF-κB 在癌症早期不会起到促进癌症发生发展的作用，还可能起到抑癌作用。但当肿瘤细胞积累足够的突变，NF-κB 进而诱导基因表达促进肿瘤发生、发展及转移。所以研究NF-κB 信号通路至关重要，通过更加深入的研究NF-κB 信号通路在肿瘤发生发展中的作用，有助于我们通过改变NF-κB 信号通路作用于肿瘤发生变化的关键时间点及调控机制，增强或减弱NF-κB 信号通路在肿瘤发生中的作用，以求为治疗肿瘤提供更好的药物和方法［19］。

本研究采用抬高lncRNA CASC2a 水平后，通过介导NF-κB 信号通路从而对TPC-1 细胞的增殖及迁移产生影响，为甲状腺癌的发病机制提供一定的实验基础。RT-qPCR 检测质粒组转染lncRNA CASC2a 的表达量，Western blot 检测比较3 组NFκB 通路蛋白表达，结果证实质粒组较空白组及空载组NF-κB 信号通路相关蛋白表达量明显减少，证明过表达lncRNA CASC2a 可抑制NF-κB 通路蛋白表达。相同转染条件，増加NF-κB 信号通路激动剂PMA，结果表明，给与PMA 刺激后，转染+PMA 组的细胞增殖及迁移能力明显较转染组减弱；相关蛋白表达却较转染组增加，而对照组的增肌、迁移能力表达量明显高于转染组与转染+PMA 组。由此我们推测lncRNA CASC2a 可能会通过NF-κB 信号通路来抑制TPC-1 细胞的增殖及迁移能力，而所有实验条件下PMA 组与对照组之间差异无统计学意义，原因为未转染的细胞在PMA 的作用下，其增殖、迁移水平可能还会受到其他通路等方面的影响，发挥不稳定甚至不同的作用，这也可能成为进一步研究的方向。

综上所述，本研究结果显示lncRNA CASC2a 在甲状腺乳头状癌细胞中呈现低表达，过表达lncRNA CASC2a 在细胞水平上可能会通过NF-κB 信号通路达到抑制TPC-1 细胞的增殖及迁移能力，但NF-κB信号通路具体作用于甲状腺乳头状癌的发生发展关键点及调控机制等还需进一步得到研究证实。