舒郁胶囊及其主要组份对经前期综合征肝气郁证大鼠海马中Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路的影响

徐凯勇, 王杰琼, 李 芳, 耿燕楠, 夏小雯, 宋春红

(1. 山东中医药大学, 教育部中医药经典理论研究重点实验室,山东省中医药基础研究重点实验室, 济南 250355;2. 北京市丰台区妇幼保健院药剂科, 北京 100067)

经前期综合征(PMS)是典型中医情志病症，肝气郁证为主要证型，肝疏泄失常为其关键病机，具体机制有待深入探索。有研究发现Ca2+的浓度变化与PMS的发生有关[1,2]。L型钙通道(Cav1.2)是细胞内Ca2+浓度调节的重要通道，细胞内Ca2+与钙调蛋白(CaM)结合可激活钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKII)，其作用底物参与调控与PMS发生有关的脑源性营养因子(BDNF)、五羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)和谷氨酸(Glu)等蛋白质和神经递质的合成和释放。我们前期研究[3]表明, PMS肝气郁证大鼠血清可显著抑制海马神经元L型钙离子电流密度，而舒郁胶囊及其有效组分含药血清则可抑制L型钙电流密度。Ehlinger等[4]研究表明, 其L型钙离子通道可以通过色氨酸神经元系统来调控情绪障碍，进一步证实了我们的前期研究。那么PMS肝气郁证大鼠海马中 Cav1.2下游的CaMKⅡ/BDNF信号通路是否有变化呢？为进一步验证舒郁胶囊及主要组份对PMS肝气郁证大鼠海马中Cav1.2介导的CaMKⅡ/BDNF信号通路的影响，我们进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性Wistar大鼠 130～150 g, 80只, 由山东中医药大学实验动物中心提供[SCXK(鲁)2011-0003]。大鼠于昼夜颠倒环境(每日于21∶00开灯, 9∶00关灯)饲养一周, 除实验期外自由饮食。实验操作在夜间、暗淡红灯(星光条件)下进行。

1.2 药品与主要试剂

舒郁胶囊由白芍、柴胡、香附、甘草有效成分配伍组成(新药临床批件2008L11169); 柴胡提取物和白芍提取物，青岛阳光海川医药科技发展有限公司生产(批号: 2011L06107、20110526和20110527)，是舒郁胶囊的两种有效成分，其制备方法以及质控指标同舒郁胶囊中该药物的制备及检测; 氟西汀，礼来苏州制药有限公司(批号H20050463); 尼莫地平德国拜尔医药保健有限公司(批号：H20003010)。CaM 一抗(SAB4503194, 美国Sigma公司); CaM-PK II一抗(4436，美国Cell Signal); p-CaMKII (Thr286) 一抗(3361，美国Cell Signal); BDNF一抗(AV41970, 美国Sigma); Tubulin一抗(M2005, Ab-mart)。山羊抗兔二抗(SB200, 远达晶美); 蛋白Marker(SM0671, Thermo Fermentas),预染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific); Protease inhibitor cocktail(Sigma，P8340)。

1.3 实验仪器

Olympus显微镜(日本Olympus CX41); 大鼠旷场实验箱 (XR-XZ301, 北京天鸣宏远科技发展有限公司); SDS-PAGE电泳仪、蛋白印迹转移装置(美国伯乐公司); 凝胶成像系统(Syngene, G: BOX chemi XR5)。

1.4 PMS肝气郁证大鼠模型制备

利用慢性束缚应激法制备模型[5]，旷场实验筛选得分相近大鼠，阴道涂片镜检结合行为学观察方法确定大鼠动情周期。选择动情行为规则出现且处于动情周期非接受期的大鼠60只(非接受期相当于人经前期)。按随机数字表的方法将大鼠随机分为6组, 分别为正常对照组(简称正常组)、PMS肝气郁证模型组(简称模型组)、PMS肝气郁证模型给予舒郁胶囊组(简称舒郁组)、PMS肝气郁证模型给予柴胡提取物组(简称柴胡组)、PMS肝气郁证造模给予白芍提取物组(简称白芍组)、PMS肝气郁证造模给予氟西汀+尼莫地平组(简称氟西汀+尼莫地平组, 阳性对照)。给药组在造模的同时每日上午8∶30灌胃给药1次, 直到造模结束。给药剂量每日分别为0.41 g/kg、0.32 g/kg、36 mg/kg和 2.7 mg/kg(氟西汀和尼莫地平)，均相当于人临床8倍剂量(柴胡和白芍提取物的剂量设计依据其在舒郁胶囊中所占的比例计算得出)。正常组和模型组大鼠灌胃等体积的灭菌饮用水。造模完成后大鼠断头处死，冰上迅速剥离海马，-70 ℃冰箱备用。

1.5免疫印迹(Western blotting) 检测 CAV1.2 下游信号通路蛋白表达水平

取出研磨好的大鼠脑组织, 冰浴中操作, 含有非离子型表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚的裂解液(RIPA方法)提取总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒测定样品蛋白含量。以 50 μg 总蛋白每泳道上样, 经 SDS-PAGE 电泳分离后，湿法转移至 NC 膜上, 用含5% 脱脂奶粉的三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液(TBST)室温封闭1 h, 分别与一抗(抗-CaM, 1∶800; 抗-CaMKⅡ, 1∶1 000; 抗-pCaMK Ⅱ, 1∶1000; 抗 -BDNF, 1∶1 000; 抗 -Tubulin, 1∶2 000)室温摇床孵育 2 h(抗体均用5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释), TBST洗膜, 10 min/次,共3次, 再与二抗(1∶2 000) 室温孵育1 h, TBST洗膜, 10 min/次, 共3次, ECL化学发光试剂检测杂交信号, 显影于X线片上, 用扫描仪对X光片灰度扫描, 采用Image J软件对图像进行灰密度分析。目的蛋白的灰度值除以内参Tubulin的灰度值以校正误差, 所得结果代表样品的目的蛋白相对含量。

1.6 数据分析

利用Xmaze动物行为分析系统(XR-Xmaze)记录大鼠的旷场试验得分; 利用GraphPad Prism 5统计软件统计各组大鼠旷场试验得分, 数据以表示，采用Image J软件对图像进行灰度值分析，One-way ANOVA进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PMS 肝气郁证大鼠模型制备结果

2.1.1 造模前后行为学观察实验前, 各组大鼠均精神状态为活泼好动，被毛有光泽、眼角干净、粪便球形。第一天束缚时，模型组和给药组大鼠表现为强烈反抗、嘶叫、双目圆睁、毛须竖立、粪便尿液明显增多; 造模结束后，正常对照组大鼠的状态与前期相同，模型组大鼠不活跃，表现为精神萎靡，毛发散乱直立、眼神呆滞，大便变稀，扎堆睡觉，反抗能力明显降低; 解开束缚纱布时，未见对峙，大多跑到角落不动。而给药组大鼠在被抓时，叫声较柔和，毛发较整洁，眼角干净，与模型组相比活动明显较多。

2.1.2 各组大鼠造模前后体质量

各组大鼠造模前后体质量比较结果见表1, 造模前各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义，造模后, 与正常组相比，模型组大鼠体质量明显降低(P＜0.001)与模型组相比，舒郁组、柴胡组、白芍组和阳性对照组大鼠体质量显著升高(P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01;P＜0.05); 与阳性对照组相比，模型组大鼠体质量显著降低(P＜0.05)。

表 1 造模前后各组大鼠体质量比较 g

2.1.3 各组大鼠旷场实验得分旷场试验得分是动物探索行为及兴奋性的总体反应，本实验结果如表2所示，造模前各组大鼠旷场试验得分无显著性差别; 造模后，与正常组相比，模型组大鼠旷场实验得分显著降低(P＜0.01); 与模型组相比，舒郁组、白芍组、阳性对照组旷场实验得分显著升高(P＜0.05)，柴胡组也呈升高趋势; 与阳性对照组相比，中药组无显著性差别，模型组大鼠得分显著降低(P＜0.05)。

表 2 造模前后各组大鼠旷场实验得分比较

2.1.4 各组大鼠糖水偏好 糖水偏好实验结果如表3所示，造模前各组大鼠糖水消耗量无差异无统计学意义; 造模后，与正常组相比，模型组大鼠糖水偏好率呈极显著性降低(P＜0.001)，与模型组相比，各给药组大鼠的糖水偏好率有极显著性升高(P＜0.001); 与阳性对照组相比，模型组大鼠糖水偏好率显著降低(P＜0.001)。

表 3 造模前后各组大鼠糖水偏好率比较 %

2.2各组大鼠海马中CaMKⅡ/BDNF信号通路中关键蛋白的蛋白及磷酸化水平

从图1，表4可以看出，与正常组相比，模型组大鼠海马中CaM蛋白表达量和CaMKⅡ磷酸化水平显著升高(P＜0.05)，BDNF蛋白的表达量显著下降(P＜0.01)，各给药组大鼠差异无统计学意义。与模型组相比, 阳性对照组大鼠海马CaM蛋白的表达量显著降低(P＜0.05), 舒郁组、柴胡组、白芍组和阳性对照组大鼠海马CaMKⅡ磷酸化水平显著降低(P＜0.01); 舒郁组、柴胡组、白芍组和阳性对照组大鼠海马，BDNF水平显著升高(P＜0.01，P＜0.05)。

3 讨论

CACNA1C编码Cav1.2亚型的α1C亚基，是Cav1.2的主要亚基，作为跨膜的通道蛋白发挥作用, 并且含有二氢吡啶类药物的结合位点。近年来CACNA1C与情感障碍性疾病的关系研究较多,通过全基因组关联研究显示该基因的多态性与抑郁、精神分裂症、双向情感障碍性疾病密切相关, 是多种情感障碍性疾病的候选基因之一, 也被认为是未来治疗精神情感障碍性疾病的新靶点[6]。本研究在前期研究的基础上进一步探讨了Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ钙通路与PMS肝气郁证发生的关系以及调肝方药的影响。

图 1 各组大鼠海马中CaM, CaMKⅡ, BDNF蛋白电泳图

表 4 各组大鼠海马中CaM,CaMKⅡ, BDNF蛋白及磷酸化表达水平

有研究表明[7]，钙离子调节紊乱是PMS的病理生理特征, 并且钙离子在神经生长中起着至关重要的作用, 皮层发育在很大程度上依赖电压依赖性的钙[8]。通过L型钙通道的电流占细胞总电流的30-50%，此通道的开放与关闭能有效调节细胞浆内钙离子水平[9]。钙离子参与突触可塑性调节[10],PMS大鼠体内钙离子浓度降低影响突触可塑性调节, 因此我们认为对钙离子浓度的调节能够在PMS病理中起到一定的作用。本实验中我们利用慢性束缚应激的方法对动情周期处于非接受期的大鼠进行PMS肝气郁证模型复制，造模完成后根据大鼠的宏观行为学表现以及旷场试验和糖水偏好实验充分验证了模型复制是成功的。在此基础上我们检测了各组大鼠下丘脑中Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ钙通路关键蛋白的表达。实验结果表明,Cav1.2介导的CaM/ CaMKⅡ在模型组大鼠中关键蛋白CaMKⅡ的磷酸化水平是升高的, 而BNDF蛋白表达降低; 造模同时给予舒郁胶囊以及有效组分后大鼠海马中上述蛋白无异常表达的现象。

CaMKⅡ磷酸化后作用的靶蛋白之一即是CREB，p-CaMKⅡ可使CREB的两个位点发生磷酸化，这两个位点分别是Ser133和Ser142, Ser133和Ser142位点的磷酸化分别能启动和抑制相关基因的转录。研究认为CaMKⅡ主要是对Ser142发挥作用。本实验没有购买到检测Ser142位点磷酸化的CREB抗体，所以我们直接检测了CREB调控的BDNF蛋白的表达。结果显示模型组BDNF表达降低。这说明CaMKⅡ磷酸化后可能通过对CREB Ser142位点的磷酸化抑制了BDNF的表达，因此结合本实验我们认为海马脑区中CaM/ CaMKⅡ的激活与PMS肝气郁证的发生有关。

舒郁胶囊是临床治疗肝气郁证的组份配伍新药，由白芍、柴胡、甘草和香附有效组分配伍而成，临床疗效显著，其有效成分对中枢神经系统有明显的调理作用。柴胡是中医治疗肝气郁结的重要药物，柴胡皂苷具有抗炎、提高免疫力，抗惊厥的作用，还可以延长睡眠，是治疗精神类的疾病有较好的疗效[11]。研究认为雌激素和孕激素均可抑制Cav1.2电流[12]，而柴胡皂苷d被认为具有雌激素样的作用[13]。白芍的主要药效成分芍药苷具有促进皮层神经元生长, 保护脑缺血后损伤的作用，可以改善神经行为学症状，增加血脑屏障通透性，增加大脑局部血流量。张广钦等[14]研究认为芍药苷可以阻断心肌细胞的Ca v1.2。Wang等[15]发现芍药苷能通过抑制PC12细胞内CaM/ CaMKⅡ来发挥其神经保护的作用。多项研究[16,17]结果也表明芍药苷对神经系统的保护作用与抑制细胞内钙超载密不可分。由此可见，以上中药配伍既能提高中枢系统的兴奋性，又有一定的镇静作用，协调平衡中枢系统的功能，其有效成分还可能抑制Cav1.2。因此我们推测Cav1.2信号通路可能是舒郁胶囊的部分作用靶点，白芍提取物和柴芍提取物中的有效成分主要作用至该通路。结合本实验结果，我们推测调肝方药可能通过抑制Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ来发挥其治疗PMS肝气郁证的作用。但对其具体作用微观机制我们还将进一步深入研究。

本研究只是从整体动物水平上得出的结果，在下一步的研究中我们拟在离体细胞水平利用激光共聚焦显微镜结合荧光标记以及电生理膜片钳技术明确舒郁胶囊有效组分提取物或者其有效单体成分对该通道的作用。为该药物在治疗精神情感障碍类等情绪类疾病的应用提供理论基础。