洗洁精对鸡胚绒毛尿囊膜血管的刺激性评价

陈梓灵, 徐颖愉, 刘香梅, 刘冬虹, 庞增雄

(广州质量监督检测研究院, 广州511447)

洗洁精作为一种重要的日常洗涤剂，除清洁、去污以外，近年来随着生活水平的提高，大众对其提出了新的要求——绿色环保以及对皮肤的低刺激或者无刺激性。在3R原则和动物福利伦理日渐受到重视的今日，多重替代动物试验的体外方法得到开发和应用[1,2]。其中鸡胚尿囊膜试验(hen’s egg test on the chorioallantotic membrane,Het-Cam)作为化妆品兔眼刺激性试验的替代试验之一，大多数评估结论认为Het-Cam在表面活性剂和以表面活性剂为基础的配方等物质的测试中与传统的Drauze兔眼试验显示较好相关性[3]。本文旨在通过Het-Cam对市面上销售的几款洗洁精的刺激性进行研究，比较Het-Cam刺激性评分与洗洁精中表面活性剂含量之间的关系，进一步探讨Het-Cam在洗洁精刺激性研究以及洗洁精质量提升中的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

5种市售洗洁精样品，均由广州质量监督检测研究院化工检验部监督抽样提供, 分别标为A、B、C、D和E。白来杭鸡0日龄鸡胚，35个，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司[SCXK(京)2014-0002]。

1.2 主要试验仪器与试剂

LRH250F型生化培养箱, 上海一恒科学仪器有限公司; Stemi 2000C型体视显微镜, 德国蔡司公司。氯化钠, 广州化学试剂厂, 批号为20140701-2; 氢氧化钠，广州化学试剂厂，批号为20141102-1。

1.4 实验方法

1.4.1 Het-Cam 将各洗洁精用去离子水配制成质量分数为1.5%的水溶液。参照出入境检验检疫行业标准SN/T 2329-2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚尿囊膜试验》[4]，由于受试物均为透明液体，本次实验采用反应时间法。0日龄鸡胚于培养箱中37.5 ℃孵育至9日龄，照蛋检查后用牙科锯齿弯镊剥去已标记气室位置的蛋壳部分。用镊子去除蛋内膜，将100 μL样品水溶液滴加于尿囊膜表面，观察Cam反映情况，并记录作用5 min内出血、血管融解、凝血的毒性效应出现的时间，并进行拍照。每种样品做6次平行试验，以质量分数0.9% NaCl溶液为阴性对照，质量分数为0.4% NaOH溶液为阳性对照。

参照文献[4]，采用刺激评分法(irritation score,IS)对试验结果进行评分，应用以下公式计算刺激评分(IS)，结果保留小数点后两位:

式中:

secH(出血时间)即尿囊膜上观察到开始发生出血的平均时间(s);

secL(血管融解时间)即尿囊膜上观察到开始发生血管融解的平均时间(s);

secC(凝血时间)即尿囊膜上观察到开始发生凝血的平均时间(s)。

1.4.2 总活性物含量测定 依据GB 9985-2000《手洗餐具洗涤剂》中附录A总活性物质含量的检测方法[5]，由本院化工检验部对各受试物进行总活性物含量测定。

1.4.2.1 活性物含量的测定称取各受试物2 g于烧杯中置(105±2)℃烘箱中2 h后取出，冷却至室温后加入50 mL三氯甲烷，置50 ℃水浴上加热至完全溶解，再冷却至室温静置沉降，倾倒上清液至过滤漏斗进行抽滤，再以三氯甲烷重复洗涤抽滤3次。将三氯甲烷溶液由抽滤瓶转入已恒重的底瓶中，通过索氏抽提器在水浴锅上回收溶剂，待底瓶内容物蒸干时加入3 mL丙酮，待完全蒸发后将底瓶放入(105±2) ℃烘箱中2 h后取出放在干燥器内冷却30 min，称重。

1.4.2.2 尿素含量的测定称取各受试物0.5 g至碘量瓶中，加入50 mL蒸馏水溶解后加入1滴甲基橙指示剂，用盐酸中和至橙色，加入0.2g尿素酶后加塞，置于50 ℃水浴中，40 min后取出冷却，用0.1 mol/L盐酸标准溶液滴定至如同中和时出现的橙色。同时设置空白试验。

1.4.2.3 结果计算

式中:

m1为三氯甲烷溶解物质量(g);

m为试验份的质量(g)

式中:

V1为样品消耗0.1 mol/L盐酸标准溶液体积(mL);

V0为空白试验消耗0.1 mol/L盐酸标准溶液体积(mL);

c为0.1 mol/L盐酸标准溶液的浓度(mol/L);

m为试验份质量(g)

2 结果

2.1 Het-Cam

根据1.4.1中的试验方法进行试验并根据公式计算IS值，具体结果见表1。由表可知，与阴性对照相比，5种洗洁精样品的出血时间和血管融解时间均有不同程度缩短，未出现凝血现象。样品中IS值最高为C款洗洁精，IS值最低为A款洗洁精，5种样品IS值均未达到阳性对照IS值。5种样品及对照组的鸡胚绒毛尿囊膜在5 min时血管及血管网的受损程度见图1。

2.2 总活性物含量检测

根据1.4.2中的试验方法进行试验并根据公式计算总活性物含量，5种洗洁精样品中总活性物含量最高为B款洗洁精，含量最低为C款洗洁精(表 1)。

表 1 5款洗洁精Het-Cam与总活性物含量检测结果Table 1 The results of Het-Cam and total active matter content in 5 dishwashing liquids

3 讨论

天然、安全和无刺激作为当今洗洁精等洗涤剂最大的卖点与未来发展方向，需要对其对生物机体的刺激性有更有效的评价方法。Het-Cam试验作为传统Drauze兔眼试验的替代试验之一，与皮肤刺激性试验对应的替代试验相比较，有着试验所需设施设备少、操作简单、费用低廉以及对表面活性剂敏感的优势。由此可见, 利用Het-Cam试验对洗洁精的刺激性进行评分，对洗洁精的配方和质量优化等有一定意义。

图 1 5款洗洁精反应5 min鸡胚绒毛尿囊膜情况Figure 1 Reaction of 5 dishwashing liquids in chick chorioallantoic membrane for 5 minutes

Het-Cam结果显示，样品C和B刺激性评分较高，分别为10.07和8.84，而样品A和D刺激性评分较低，分别为5.69, 6.75。而相应的总活性物含量也分别为15.34%、28.21%和16.37%、17.14%。由此可得，洗洁精刺激性与洗洁精中总活性物含量具有一定的正相关性，总活性物含量较高的洗洁精的刺激性评分大部分偏高。因此，Het-Cam可以初步测定不同洗洁精产品的刺激性，在研究洗洁精刺激性方面具有可行性。但是洗洁精的刺激性评分并不严格随着总活性物含量升高而升高，样品C的Het-Cam刺激性试验评分是5个样品中最高，IS评分为10.07，但其总活性物含量在5款洗洁精中为最低，分析原因，可能与配方其他成分、原料品质、制作工艺或产品生产过程中产生的其他风险物质有关。在常规的洗洁精理化检测项目中，检测项目一般为总表面活性物质或单一活性物质的含量，仅从活性物的含量对洗洁精的刺激性进行判断，容易忽视活性物质原料质量以及活性物质配方引起的洗洁精刺激性的变化。从Het-Cam结果可以看出，在以总活性物种类和含量作为洗洁精质量高低的标准的同时，也需要对其原料质量、配方等进行考量，因此，使用Het-Cam对洗洁精的刺激性进行评分，也有助于洗洁精的质量优化。

表面活性剂对皮肤的刺激作用主要体现在当它与皮肤角质层中的蛋白质和脂质相互作用后，会破坏角质层屏障, 导致皮肤出现红斑、干燥和瘙痒症状[6]。例如十二烷基硫酸钠(SLS)作为表面活性剂中阴离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的一种, 具有抗硬水性好, 气泡性能、湿润性能好, 与皮肤有良好的相容性的特点, 被广泛应用于香波、沐浴用品、剃须膏等盥洗卫生用品和各种洗涤剂、清洁剂中[7]。但是实验表明SLS作用于角质层的脂质及蛋白结构, 引起肿胀并破坏角质层, 致使其屏障功能受到影响。低浓度的SLS(低于1%)主要导致皮肤屏障的损伤，高浓度的SLS(高于1%)引起强烈的炎症反应和皮肤屏障损伤的进一步增强[8]。本次试验也证明市售成品稀释至1.5%时，以表面活性剂为主要配方物质的洗洁精仍然对鸡胚绒毛尿囊膜有较大的刺激性。

综上所述，Het-Cam在洗洁精刺激性评价方面既具有可行性，也具有试验意义。我们也将进一步探索Het-Cam在洗洁精刺激上的更详细具体的试验方法和等级划分方法。