CYP11B1和CYP11B2基因多态性与醛固酮瘤发病风险的相关性

黄若辉，康欢，邹晓峰，张国玺，王保军，欧阳金芝，马鑫，张旭，曾庆明，曾晓鹏

(1 赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000；2 赣州市立医院；3 中国人民解放军总医院)

原发性醛固酮增多症(Conn综合征)是导致继发性高血压(SH)最常见的病因，与心血管疾病的发病率和病死率相关。醛固酮瘤(APA)是肾上腺皮质肿瘤中常见的一种有功能的良性肿瘤，是原发性醛固酮增多症(PA)常见的一种亚型[1]。醛固酮作为APA与其病理生理和临床表现之间的中介物质，控制其合成的醛固酮合酶主要是由醛固酮合酶(CYP11B2)基因编码；其在肾上腺皮质的球状带中由胆固醇通过系列生化反应转化而成，其中包括许多羟化反应；催化这些羟化反应的酶是一些特异性的细胞色素P450酶，同时还与合成醛固酮的限速酶类固醇激素合成急性调节蛋白相关[2]。由于CYP11B2基因与编码11-β羟化酶(CYP11B1)的基因前后排列于人类8号染色体(8q24)，两基因相似率达到近90%，在功能上也密切相关。我们的前期研究和其他研究提示，CYP11B2和CYP11B1基因多态性可能与APA存在相关性[3，4]。本研究进一步检测APA患者CYP11B2和CYP11B1基因的其他单核苷酸多态性(SNP)位点，探讨此二者基因多态性与APA发病的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年5月～2017年6月赣南医学院第一附属医院及中国人民解放军总医院泌尿外科接受手术治疗的APA患者80例(APA组)，经病史、血生化及B超、CT等检查诊断为APA，术后经病理检查证实。选取101例同地区体检健康者作为对照组，排除肾上腺相关疾病史，均无高血压家族史、心脑血管疾病史、内分泌疾病史及肿瘤等疾病史，并经B超等检查排除肾上腺占位，且均无血缘关系。APA组男38例、女42例，年龄(45.10±17.11)岁，汉族，收缩压(166.10±15.24)mmHg，舒张压(102.70±15.89)mmHg，血钾(2.46±0.51)mmoL/L；对照组男48例、女53例，年龄(49.00±11.19)岁，汉族，收缩压(132.00±14.41)mmHg，舒张压(77.90±8.49)mmHg，血钾(4.30±0.55)mmoL/L。两组性别、年龄、民族具有可比性(P均>0.05)，APA组收缩压和舒张压均高于对照组而血钾明显低于对照组(P均<0.001)。本研究经中国人民解放军总医院及赣南医学院第一附属医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 CYP11B1和CYP11B2基因多态性检测方法

1.2.1 基因组DNA提取 两组均在清晨7时空腹状态下抽取外周静脉血5 mL，EDTA抗凝；利用全血基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司)提取外周血基因组DNA，-80 ℃保存备用。

1.2.2 多态性位点选择 根据相关文献和公共SNP数据(http://ncbi.nlm.nih.gov/SNP/和http://www.hapmap.org/)选择CYP11B2和CYP11B1基因中频数≥0.05，或文献报道与高血压病相关的SNP位点共7个(CYP11B1基因rs5301、rs6471570， CYP11B2基因rs3802228、rs3802230、rs4545、rs4546、rs6433)。

1.2.3 基因多态性检测 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)TaqMan-MGB 探针法检测CYP11B1基因rs5301、rs6471570和CYP11B2基因rs3802228、rs3802230、rs4545、rs4546、rs6433 SNP位点。引物和探针均由美国Applied Biosystems公司设计并合成，利用ABI7500 real-time PCR系统进行PCR扩增。各位点基因多态性的PCR反应体系总量皆为20 μL，每个反应体系DNA含量约为15 ng。PCR扩增循环条件：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。应用美国Applied Biosystems公司SDS软件对各个等位基因差异进行基因分型。随机选取约10%的样本进行DNA测序，基因型符合率100%。

1.2.4 统计学方法 采用SHEsis在线平台进行Hardy-Weinberg平衡检验，Haploview4.0软件进行连锁不平衡(LD)分析，SNPassoc1.9-2进行基因型分析，Haplo Stats2.17.0软件进行单体型重建，SPSS14.0软件和R statistics program 3.1.2程序包进行统计学处理。计数资料以百分率表示，组间比较行χ2检验和Logistic检验，比值比(OR)及其95%可信区间(CI)表示相对风险度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP11B1、CYP11B2基因SNP位点的Hardy-Weinberg平衡及LD分析结果 对照组中所选7个位点中除rs3802230外均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)，rs5301、rs6471570、rs3802228、rs3802230、rs4545、rs4546、rs6433所对应P分别为0.46、0.15、0.94、0.01、0.44、0.23、0.38；LD强度以D′值表示，rs3802230与rs3802228间的LD强度最大(D′=0.910)，而rs4545与rs6471570间的LD强度最弱(D′=0.220)。

2.2 两组CYP11B1、CYP11B2基因SNP位点等位基因、基因型分布比较 APA组CYP11B1基因rs5301位点的A等位基因和CYP11B2基因rs3802228位点的A等位基因、rs6433位点的G等位基因频率均高于对照组(P均<0.05)，见表1；将性别、年龄及BMI校正后，APA组CYP11B2基因rs4545位点AG基因型频率低于对照组(P<0.05)，而纯合子GG基因型差异无统计学意义。见表2。

表1 两组CYP11B1、CYP11B2基因SNP位点等位基因分布比较

表2 两组CYP11B1、CYP11B2基因SNP位点基因型分布比较

注：a为按性别、年龄及BMI校正后。

2.3 两组CYP11B2、CYP11B1基因SNP位点单体型分布比较 单体型中各位的顺序为rs5301、rs6471570、rs3802228、rs3802230、rs6433、rs4545、rs4546，频率>3%的单体型有GCACAAC、GAACAAC、GCGAAGT、GCACAGC，其中APA组GAACAAC、GCGAAGT频率低于对照组(P=0.012，OR=0.73，95%CI为0.57～0.93；P=0.012，OR=0.81，95%CI为0.69～0.95)。见表3。

3 讨论

研究表明，APA与多个基因、多个通路的异常存在关联(如Wnt/β-catenin、KCNJ5等)，同时还可能有长链非编RNA参与调控相关基因[5,6]，而本文仅就多态性进行进一步研究。研究发现，汉族人群CYP11B2基因多态性位点rs3802230与血压存在关联，且该位点C等位基因与高血压易感性呈正相关；rs4546与-344C/T组成的单体型与APA发病率存在关联，并影响血压；进一步研究发现，醛固酮可通过rs3802228、rs6433发挥作用，与高血压患者心脏功能改变有关，且rs6433与醛固酮代谢有关。在选择部分已报道位点进一步验证的同时，我们通过公共SNP数据选择CYP11B1基因rs5301、rs6471570多态性位点进行研究。

表3 两组CYP11B2、CYP11B1基因SNP位点单体型分布比较

注：a为按性别、年龄及BMI校正后。

Barr等[7]发现，CYP11B2基因-344T、intron2C可以增加APA的发病风险。在单体型研究中发现，由CYP11B2基因多态性位点组成的-344T/173K单体型相对于其他单体型CYP11B2基因表达呈上调趋势，与原发性高血压(EH)有关，并影响醛固酮的合成。部分研究发现，CYP11B1基因多态性(如rs6410等)与EH患者的相关性是通过CYP11B1活性的降低、醛固酮合成增加来实现的[8]。Barr等[7]研究格拉斯哥人群发现，Conn综合征患者中CYP11B2基因含-344T等位基因、intron2W/C基因型频数高于正常人群；推测相关基因型可影响醛固酮的分泌，从而增大APA的患病风险。而且，在APA患者中，含有CYP11B2基因-344T/173K的单体型CYP11B2基因的表达明显上调。Rossi等[9]研究意大利高血压人群发现，CYP11B2基因-344C/T位点TT型在低肾素高血压患者中升高，认为该基因型可能在功能型突变导致的LD中扮演重要作用。在台湾人群中发现，CYP11B2基因-344T>C含有基因型TT较TC、CC在女性患者存在疾病易感性[10]。McManus等[11]认为，CYP11B2基因多态性的不同基因型可与相关基因作用产生效应，例如APEX1可能是一个抑制作用基因，但这种抑制作用与CYP11B2基因-1651T/C有关。Iwai等[12]选取CYP11B2和CYP11B1基因上35个多态性位点进行分层研究，发现CYP11B2基因-344T>C与其他多态性位点具有较强的LD关系，同时CYP11B2基因rs179998(344T>C)TT基因型相对于TC、CC基因型对盐皮质激素的更敏感，血压升高更明显。王保军等[13]发现，CYP11B2和CYP11B1基因多态性位点rs179998、rs4539与CYP11B2基因的表达上调存在关联，单体型如AGAConvT、AGAWtC表达也上调，其中由intron2W/C的C等位基因、rs13268025的C等位基因及rs13268025、rs1799998、intron2W/C、rs4539、rs3097、rs6410、rs6387组成的单体型GAGACTC使得APA发病风险明显提高。

本研究结果显示，APA组中CYP11B1基因rs5301位点的A等位基因及CYP11B2基因rs3802228位点的A等位基因、rs6433位点的G等位基因频率高于对照组，且rs4545位点杂合子AG比例较对照组降低。至于其具体机制，有研究认为，CYP11B2基因和CYP11B1基因部分多态性通过基因转录调控影响该基因的表达，改变CYP11B2基因和CYP11B1基因对类固醇合成因子的敏感性，导致CYP11B1活性降低，醛固酮合成增加，从而增加APA发病风险。多个SNP组成的单体型与疾病发生和发展具有相关性,含有CYP11B2基因-344T/173K的单体型APA发病风险明显增加[14]。本研究发现，GAACAAC、GCGAAGT单体型与APA发病风险具有相关性，但CYP11B2基因rs3802228、rs3802230、rs4546、rs6433和CYP11B1基因rs5301、rs6471570多态性位点其基因型分布频率在两组差异无统计学意义。这种结果的差异可能与不同种族的不同遗传背景和不同种族间基因多态性之间的LD模式不同等因素有关。

总之，CYP11B1基因和CYP11B2基因多态性与APA具有关联。其中，CYP11B2基因多态性位点rs4545与APA人群有关，且CYP11B2基因和CYP11B1基因组成的单体型GAACAAC、GCGAAGT与APA发病风险呈负相关。