舒心通脉颗粒提取工艺的优化

周 泉，王晗雪，李素丽，张慧倩，李国文，程雪梅，陈 颖∗，王长虹∗

（1.上海市中西医结合医院，上海 200082；2.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海市复方中药重点实验室，上海中药标准化研究中心，上海 201203）

舒心通脉方是临床用于治疗慢性心衰达数十年之久的院内制剂，由炮附子、干姜、白术、黄芪、蒲黄5 味药材组成［1］，取附子辛热之性，温补心肾之阳，通行血脉；辅以干姜，以温通全身阳气；益以白术、黄芪、蒲黄，化瘀而不伤正，诸药相伍，以达舒心通脉、益气活血之效。本方临床应用时剂型为水煎剂，存在使用不便等缺点，故有必要在传统汤剂的基础上研制成颗粒剂、片剂或胶囊剂等固体剂型，以便于临床使用。

提取工艺试验设计方法主要有均匀设计、正交试验设计，但均存在精度不够、模型预测性较差等缺点，而且取值仅仅是接近最佳取值，无法精确到最佳点，不能灵敏地考察各因素之间的交互作用等缺陷［2］。鉴于此，近年来常用集数学和统计学方法于一体的星点设计-响应面法进行设计，具有试验次数少、精度高等特点，在药学领域广泛应用［3］，并且大多采用多指标评价体系权重赋分的方法［4］，它分为主观赋权法和客观赋权法［5］，前者中G1 法是对层次分析法（AHP）进行改进的主观赋权法，具有计算速度快、无需一致性检验等优点［6］，而后者中熵权法可与其他方法组合使用［7］，从而优选出合理可行的提取工艺参数。因此，本实验采用星点设计-响应面法结合G1-熵权法优化舒心通脉颗粒提取工艺，为该制剂临床应用提供参考。

1 材料

Waters e2695 HPLC 色谱仪（配置四元泵、Waters 2998紫外检测器、柱温箱，美国Waters 公司）；EYELAN-3000旋转蒸发仪（日本Rikakikai 公司）；BSA124S-CW 电子分析天平（万分之一）、BT25S 电子分析天平（十万分之一）［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；ZNHW 电热套（上海羌强仪器设备有限公司）。毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号130030-201801，含有量98%）、香蒲新苷（批号240012-201805，含有量98%）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（批号250069-201801，含有量98%）对照品均购于上海鸿永生物科技有限公司；6-姜辣素对照品（批号Y11J9H65403，含有量98%）购于上海源叶生物科技有限公司。炮附子、干姜、白术、黄芪、蒲黄饮片均购于上海康桥中药饮片公司，经上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定为正品。甲醇、磷酸为色谱纯（美国Fisher 公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 含有量测定

2.1.1 色谱条件 BostonC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.5% 磷酸（B），梯度洗脱（0～15 min，35% A；15～22 min，35%～45% A；22～45 min，45%～95% A）；检测波长254 nm（0～30 min）、280 nm（30～45 min）；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.1.2 供试品溶液液制备 按处方量精密称取炮附子（黑顺片）适量，加5 倍量水，先煎1.5 h，其余4 味药材加入上述药液，再加5 倍量水煎煮45 min，合并，浓缩至密度为1.01 g／mL，精密量取适量，浓缩4 倍，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，70%甲醇制成每1 mL 分别含毛蕊异黄酮葡萄糖苷95.0 μg、香蒲新苷94.6 μg、异鼠李素-3-O-新橙皮苷85.0 μg、6-姜辣素93.2 μg 的溶液，即得。

2.1.4 线性关系考察 取“2.1.3”项下对照品溶液，稀释后摇匀，在“2.1.1”项色谱条件下进样20 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素方程分别为Y=63 270X+19 036（r=0.999 9）、Y=29 920X+805.66（r=1）、Y=35 150X-1 764.3（r=0.999 9）、Y=11 006X+3 967（r=0.999 9），分别 在0.475～95.0、2.37～94.6、2.13～85.0、4.66～93.2 μg／mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取高（66.5、66.2、59.5、65.2 μg／mL）、中（47.5、47.3、42.5、46.6 μg／mL）、低（28.5、28.4、25.5、28.0 μg／mL）质量浓度对照品溶液，同1 d 内在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素峰面积RSD 分别为高（0.11%、0.49%、0.42%、0.09%）、中（0.36%、0.28%、0.58%、1.53%）、低（0.34%、0.64%、0.44%、0.39%），表明仪器日内精密度良好；连续测定3 d，测得各成分峰面积RSD 分别为高（0.67%、0.79%、0.85%、0.94%）、中（0.60%、0.38%、1.03%、1.64%）、低（0.39%、0.57%、1.56%、0.76%），表明仪器日间精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密量取供试品贮备液100 mL，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素含有量RSD 分别为1.31%、0.86%、1.02%、1.92%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素峰面积RSD 分别1.14%、1.02%、0.67%、0.30%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取“2.1.2”项下含有量已知的供试品溶液20 mL，置于50 mL 量瓶中，加入50%、100%、150%水平的对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素平均加样回收率分别为97.29%、99.80%、96.65%、101.52%，RSD分别为1.01%、1.80%、1.15%、1.79%。

2.2 评价指标组合赋权

2.2.1 G1 法主观赋权［6］。步骤1：确定各指标顺序关系，设同级评价指标为｛x1，x2，…，xm｝，确定顺序关系。步骤2：设xk-1与xk的重要程度之比的相对重要程度记为rk，且（k=m，m-1，…，2）。步骤3：计算权重系数公式为、wk-1=rkwk（k=m，m-1，……，2）。

2.2.2 熵权法客观赋权 步骤1：原始数据矩阵归一化，设m个评价指标、n个评价对象的原始数据矩阵为X=（xij）n×m，对其归一化后得到属性矩阵R=（rij）n×m，对效益型属性（指属性值愈大愈好的指标）而言，进行归一化［9］，公式为rij=（xij -xmin）／（xjmax-xjmin），其中xij为第i个评价对象的第j项指标数据，xjmax、xjmin分别为xij的最大值、最小值，i=1，2，…，n；j=1，2，…，m。步骤2：求取指标熵值［10］，公 式 为，k=1／lnn，当fij=0 时，xijlnn=0。步骤3：计算指标信息权重［10］，公式为。

2.2.3 组合权重确定 设定由G1 法得到的主观权重为w1，熵权法得到的客观权重为w2，组合权重wj计算公式为。依据复方“君臣佐使”配伍原则及功效相关药效物质，由G1 法确定4 个评价指标重要性依次为毛蕊异黄酮葡萄糖苷含有量＞干浸膏质量＞6-姜辣素含有量=香蒲新苷+异鼠李素3-O-新橙皮苷含有量，权重评价标度分别为r2=1.8、r3=1.4、r4=1.0，求得主观权重值w1，再采用熵权法计算各指标客观权重值w2，然后计算组合权重值w和综合评分，最后进行直观分析和方差分析，具体权重见表1。

2.3 星点设计-响应面法优化 选择加水量（A）、提取时间（B）作为影响因素，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、6-姜辣素、香蒲新苷+异鼠李素-3-O-新橙皮苷含有量及浸膏得率作为影响指标，每个因素设5 个水平，用-α、-1、0、1、α 来表示（α=1.414），因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4。

表1 提取工艺评价指标权重值

表2 因素水平

表3 试验设计及结果

表4 方差分析

然后，通过Design-Expert 8.0.6 软件得到多元线性方程Y1=43.990 67+3.640 34A+0.137 38B（r=0.794 2，P=0.006 9 ＜0.05）、二项式回归方程Y2=-91.674 48+22.946 59A+2.070 35B-0.047 417AB-0.858 62A2-0.016 209B2（r=0.924 5，P=0.007 6＜0.05），可知后者相关系数较大，拟合效果较好，可用于分析预测。由表4 可知，各因素影响程度依次为A＞B，A 有显著性影响（P＜0.01），响应面分析见图2。由此确定，最优提取工艺为加水量12.17 倍，煎煮时间45.67 min，预测评分94.81，考虑到实际生产需要，将其修正为加水量12 倍，煎煮时间45 min。

图2 各因素响应面图

2.4 提取次数考察 固定加水量为12 倍，提取时间为45 min，分别提取1、2、3 次，进行综合评分，结果见表5。由表可知，提取2 次时已达到3 次的84%，故从资源成本、生产情况角度考虑，选择2 次作为提取次数。

表5 提取次数考察结果

2.5 验证试验 按照优化工艺［炮附子加6 倍量水先煎1.5 h，其余4 味药材（干姜、白术、黄芪、蒲黄）倒进上述药液，加6 倍量水煎煮45 min，滤过，药渣加12 倍量水煎煮45 min，滤过，合并滤液，浓缩至密度为1.01 g／mL］进行3 批验证试验，结果见表6，可知工艺合理可行，重复性、预测性良好。

表6 验证试验结果（n=3）

3 讨论

2015 年版《中国药典》中明确记载，附子味辛、甘，大热，有毒，用量3～15 g，需先煎、久煎。文献［11-16］报道，附子中双酯型生物碱毒性极大，容易导致人体中毒，但在加热过程中会转化成单酯型生物碱，从而降低毒性，故本实验采用炮附子（即药典收录品种黑顺片）。药典规定，附片中含双酯型生物碱以新乌头碱、次乌头碱、乌头碱总量计，不得超过0.010%，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总量不得少于0.010%。在工艺考察中，由于水煎液无法浓缩与药典规定一致的质量浓度，低于检测限，无法将其纳入工艺考察指标内，故未改变其先煎时间，仍按照原工艺先煎1.5 h。

本实验选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷、香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素含有量作为指标成分，与2015年版《中国药典》一致，而且它们转移到水煎液中时可达到量质传递过程的监控，同时还对黄芪中毛蕊异黄酮进行了指认，但其含有量较低，对工艺优化影响不大，故未纳入考察指标中。然后，以上述4 个成分含有量及浸膏得率为评价指标，通过星点设计-响应面法结合G1-熵权法对舒心通脉颗粒提取工艺进行优化，发现与原工艺相比，最优工艺在未降低提取效率的前提下用水量减半，既提高了生产效率，又产生了节约资源、保护环境的社会效益。由此可知，该方法科学合理，真实可靠，优化工艺参数稳定可控，有效成分得率较高，可为舒心通脉颗粒工业化生产提供实验依据。