温肾化痰方对ApoE 基因敲除小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 等基因及其相关蛋白表达的影响*

林海丹，陈铭泰，庄震坤，张 忠△，刘彩如

（1. 广州中医药大学第四临床医学院，广东 广州510006；2. 广州中医药大学深圳市中医院心血管科，广东 深圳518100；）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管意外的基本病理基础。其形成发展与凋亡基因密切相关。大量研究表明，控制动脉粥样硬化甚至逆转其发展趋势，可以减少急性心脑血管事件意外发生。AS 主要为血管内膜发生脂质等物质沉积，中层血管平滑肌增殖迁移，导致内膜增厚，从而形成粥样病变[1-2]。Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 等基因在该病理过程中起关键作用。本实验通过检测不同分组的ApoE 基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 基因及其对应的蛋白，从动物实验方面进行基因及蛋白研究，为温肾化痰方调节动脉粥样硬化提供基因及蛋白层面的实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物、饲料与药物 6 周龄ApoE-/-小鼠，均为雄性，体质量20～30g，SPF（Specific pathogen Free，SPF）级，实验前普通饲料喂养1 周。高脂、高胆固醇饲料含1%胆固醇及5%猪油。温肾化痰方：仙茅10 g，仙灵脾10 g，石菖蒲15 g，瓜蒌皮15 g，乳香15 g 加工制成含生药0.5265 g/mL 中药浓缩液，由广州中医药大学附属第一医院中药房提供。阳性对照药为阿托伐他汀钙片（20 mg/片，辉瑞制药有限公司）。

1.2 动物分组与给药 将ApoE-/-小鼠120 只按体重分层随机法，平均分为6 组，分别为空白对照组、易损斑块组、阳性对照组、低、中、高剂量中药组。普通饲料喂养空白对照组12 周。高脂、高胆固醇饲料喂养剩余5 组小组8 周后继而予高脂饲料喂养4周。空白对照组及易损斑块组小鼠均不给药，予生理盐水1 mL/d 灌胃，阳性对照组予阿托伐他汀钙喂养5 mg/kg·d-1，低、中、高剂量中药组分别予温肾化痰方5.256 g/kg·d-1、10.053 g/kg·d-1、20.106 g/kg·d-1喂养，以上药液均在8 周后开始灌胃给药4 周。

1.3 Western blot 法检测蛋白表达 配制Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶及浓缩胶后，称取组织后裂解离心，取上清液，用BCA 蛋白定量检测试剂盒进行组织蛋白定量，将定量裂解后的样品取100 μL 加入5X 蛋白上样缓冲液25 μL 混匀。电磁炉煮沸处理15 min，冷却后待用。

Western blot 法检测蛋白表达：将样品滴加到凝胶孔内电泳；转膜；取膜放置脱脂奶粉（浓度5%）封闭孵育；结束后PBST 洗膜；再加入用PBS 含1%的BSA 为稀释液的一抗摇床振荡孵育1 h；孵育结束后PBST 洗膜；加入HRP 标记的二抗振荡孵育1 h；孵育结束后PBST 洗膜；ECL 发光显影，定影。使用ImageJ软件分析条带灰度值并进行统计分析。

1.4 RT-PCR 检测mRNA 表达 样品研磨成粉后于离心管中反复振荡裂解，加入Trizol 吹打裂解；加入氯仿剧烈震荡1 min 后静置5 min 后12 000r 离心10 min；取上清液移至异丙醇EP 管中混匀离心10 min；去上清，加入乙醇离心5 min，去上清；干燥后DEPC 溶解；与DNaseⅠ等配置反应液；加苯酚后离心；再取上清液加氯仿后离心；再取上清液后加异丙醇静置、离心、去上清；乙醇洗涤、风干；加DEPC 溶解；在PCR 管中加入RNA、引物混合物70℃保温10 min 后迅速在冰上冷却2 min；加入RNA/引物变性溶液等试剂后42 ℃保温60 min、72℃保温15 min、-20℃保存备用；cDNA 稀释10 倍；加入引物、ddH2O 等配制反应体系；使用PRIMER5 软件/NCBI 在线设计引物；使用ViiA7 software 设定反应条件并分析基因扩增曲线和溶解曲线。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件统计分析，数据用均数±标准差（s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组之间的比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

图1 各蛋白条带灰度情况

表1 各蛋白相对灰度值

2.1 用药前后各组蛋白表达情况 给药4 周后，各组条带灰度情况如下（见图1 及表1）。各组小鼠内参蛋白条带基本一致，即各组小鼠样品上样量基本一致。与空白对照组相比，易损斑块组的Orail1、Caspase3、Caspase9、Bax 蛋白表达上调，BCI-2 蛋白表达则下调明显，表明易损斑块组的促进凋亡的相关蛋白增加，抑制凋亡的BCI-2 蛋白减少。与易损斑块组相比，余5组的Orail1、Caspase3、Caspase9、Bax 蛋白表达下调，且中药剂量越大，下调程度越明显，表明温肾化痰方能下调促凋亡的相关蛋白的表达；同时余5 组的BCI-2 蛋白表达上调，且上调程度随中药剂量增加而增加，即表明温肾化痰方能上调抑制凋亡的BCI-2 蛋白表达。与阳性对照组相比，温肾化痰方各剂量组下调促凋亡的相关蛋白及上调抑制凋亡的相关蛋白的作用一致。且其作用随中药剂量的增加而增强。高剂量中药组作用与阳性对照组条带基本一致，说明高剂量温肾化痰方的作用与阿托伐他汀钙作用基本一致。

2.2 各组大体标本情况

图2 各组大体标本情况

2.3 用药前后各组mRNA 表达情况 给药4 周后，各组基因相对样品模板量见表2。

表2 各组基因相对样品模板量结果比较

表2 各组基因相对样品模板量结果比较

各组基因相对样品模板量2-△△CT相比结果显示：易损斑块组的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 含量均比空白对照组明显上升，而Bcl2 含量比空白对照组明显下降，统计有显著性差异（P＜0.01）。阳性对照组的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax、及Bcl2 含量与空白对照组相比基本一致，统计无显著性差异（P>0.05）。各中药组的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 含量与易损斑块组相比，随中药剂量增加而下降，而Bcl2 含量则随中药剂量增加而增加。其中高剂量中药组与阳性对照组及空白对照组相比，其各组基因含量无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性退行性改变，由脂质等物质沉积管壁，引起细胞吞噬并泡沫化，进而血管平滑肌细胞增殖迁移，从而导致管壁硬化、管腔变细等病理性改变[1-2]。Orail 是质膜上的控制Ca2+流通的跨膜蛋白，在血管平滑肌细胞、上皮细胞等多种细胞中表达[3-4]。其在被激活状态下构建钙释放激活钙通道，从而调节Ca2+进入细胞，调控细胞分化、凋亡[5-7]。研究表明，Orail 与动脉斑块硬化发生发展起促进作用[8]。Bax 属Bcl-2 家族成员，在细胞凋亡中也起到促进作用，尤其促进不稳定型粥样斑块的增生[9-10]。Bax 促进平滑肌细胞发生凋亡，释放炎性因子，加重炎性反应，同时细胞碎片促进血栓形成，影响斑块稳定[10-11]。而Bcl-2 是细胞凋亡的关键调控原癌基因，主要参与调节心肌细胞凋亡过程，作用与Bax 相反，即主要阻止Caspase9 及后续的Caspase3 的一系列活化，从而促进细胞生存，逆转细胞凋亡的发生[12-15]。Caspase3、Caspase9 均属Caspase 家族中促凋亡的基因及相对应的酶。Caspase 家族属半胱氨酸天门冬氨酸蛋白水解酶，在细胞凋亡中是多条凋亡机制通路的核心汇聚点，其中Caspase9 起启动作用，而Caspase3 起效应作用，且Caspase3 活性最高，特异性彻底裂解底物使细胞最终凋亡[16-18]。

大量研究表明，ApoE（载脂蛋白E）的基因多态性与血脂异常、动脉粥样硬化有密切的相关性[19-21]。为排除ApoE 基因干扰，本实验选用ApoE 基因敲除小鼠为实验对象，建立动脉粥样硬化易损斑块模型，观察温肾化痰方对小鼠相关促进或抑制斑块形成的基因及其蛋白的影响。温肾化痰方由广东省名中医罗陆一教授根据经典名方二仙汤结合个人经验及科研成果加减化裁而来，由仙灵脾、仙茅、石菖蒲、瓜蒌皮、乳香等药味组成。其中仙灵脾辛温，归肝肾经，补肾强骨；仙茅辛温，入肾，温肾壮阳；石菖蒲辛苦温，归心胃经，化湿豁痰，活血理气；瓜蒌皮甘寒，归肺胃经，化痰利气宽胸；乳香辛苦温，活血止痛。全方有活血化瘀、温肾助阳的功效。课题组认为本病为年老肾阳衰微，痰瘀阻滞，故发本病，当以温肾化痰为法，故以此方为实验治疗方。

通过实验可知，与易损斑块组相比，温肾化痰方可明显下调Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 的基因及蛋白表达。表明温肾化痰方可通过降低促凋亡基因的表达及相应蛋白的激活及表达，从而降低细胞凋亡及增殖的几率，延缓甚至改善动脉粥样硬化斑块的进展。同时温肾化痰方可上调Bcl-2 的基因及蛋白表达。表明温肾化痰方可增加抑制细胞凋亡的基因表达，截断Caspase 级联反应，从而减少平滑肌细胞的凋亡及增殖，正向抑制动脉粥样硬化的发生发展。高剂量中药组与阳性对照组相比，统计学无显著性差异，表明高剂量温肾化痰方调节相关基因及蛋白的作用与阿托伐他汀钙一致，但要注意剂量问题。从这方面又可表明中医药的疗效与剂量有密切关系。温肾化痰方如何调节相关基因的表达，通过何种或多种组分如何进行药理反应，实验中尚未可知，具体药理机制需待进一步研究。

综上所述：温肾化痰方可通过调节与血管平滑肌细胞的凋亡、增殖相关的基因及蛋白表达，从基因层面降低血管平滑肌细胞的凋亡率，改善动脉粥样硬化斑块形成及发展，从而起到保护心血管的作用。