推拿对膝骨性关节炎大鼠滑膜TRAF6、NF-κBp65 mRNA 及蛋白的影响*

曲崇正，刘 姣，陶 静，江钢辉

（1. 广州中医药大学第三附属医院，广东 广州510360；2. 广州中医药大学，广东 广州510405）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的慢性退行性疾病，主要病变特征为关节软骨损坏、关节囊退变及滑膜炎症反应，早期主要表现为关节肿痛，发展至中晚期可出现关节畸形、活动障碍等[1-5]。目前的临床研究证明，推拿可以有效防治膝骨性关节炎[6-7]，但其机制不够明确。近来研究发现，膝骨性关节炎的病变除了与软骨的退变相关外，滑膜也占据主导地位[8-9]。TLR4/NF－κBp65 信号转导通路是近年来膝骨性关节炎方面研究较多的炎症通路，而NF-ΚBp65、TRAF6 是这条通路中的2 个关键致炎因子[10]。本实验通过观察膝骨性关节炎大鼠滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 及蛋白的表达，探讨推拿治疗膝骨性关节炎的机制。

1 材料和方法

1.1 设计 随机对照动物体内实验

1.2 时间及地点 实验于2018 年3 月22 日至2018年5 月19 日在广州中药大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 3 月龄健康SPF 级SD 雌性大鼠50 只，体质量180～220 g，由山东省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（鲁）20140007。所有实验大鼠均在SPF 级实验室中饲养，不限饮食，自由进食饲料和水。

单位在用该方法来展开分析时，其需要把成本看成是产量的函数，然后再从此角度来展开研究，当得出结论之后，其需要与原始的成本与当前的结果进行成本区分，即主要分为两大类型。需要注意的是，联系成本与产品自身的动态分析，其是构成管理会计的重要部分。

1.3.2 实验用主要试剂 荧光定量PCR 检测试剂盒（AOPR-1200，Genecopies）；TRIzol Reagent（DP424，天根）；逆转录试剂盒（DBI-2220，DBI）；DEPC（V900882，Vetec）；木瓜蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司S10011，CAS：9001-73-4）；塞来昔布（辉瑞制药有限公司，国药准字J20140072）；Anti-NF-kB p65 antibody（Abcam，8242T）；RP-Goat Anti-Mouse IgG（Jackson，115-035-003）。

4 周推拿、灌胃给药治疗结束后处死所有大鼠，取出膝关节滑膜用于荧光定量PCR、Western blot 检测。

2.3 各组滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 的表达水平

1.4 方法

1.4.1 分组与造模 采用随机化的原则，抽取10 只大鼠为空白组，余下40 只大鼠采用木瓜蛋白酶法[11-12]制作大鼠膝骨性关节炎模型，待造模成功后，再将造模大鼠随机分为模型组、推拿组、灌胃组、推拿加灌胃组，每组10 只。

1.5 主要观察指标 实时荧光定量PCR 检测各组大鼠滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表达水平；Western blot 检测TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表达水平。

2.2 滑膜形态观察 经肉眼观察，空白组大鼠滑膜平滑光亮，呈粉红色，薄而柔润。模型组大鼠滑膜颜色较深，组织水肿、变厚。推拿组、推拿加灌胃组大鼠滑膜组织颜色较正常稍变深，灌胃大鼠滑膜颜色呈红色。

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1.3.3 实验设备 荧光定量PCR 仪（7500，ABI）；基因扩增仪（9600，珠海黑马）；多功能酶标仪（上海现科仪器有限公司）；扫描仪（Canon）；暗匣（广东粤华医疗器械厂有限公司）；感光胶片（kodak）；电泳仪（北京六一仪器厂）；台式高速离心机（D3204R，SCIlogex）；微量核酸定量仪（SMA4000，Merinton）；灰度分析软件（Image J）。

1.4.3 荧光定量PCR 检测TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表达 运用Trizol 法对大鼠膝关节滑膜进行总RNA 提取，然后进行逆转录操作，严格按照试剂盒说明书进行，荧光定量PCR 检测TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表达水平。本实验采用GAPDH 作为内参，引物序列见表1。

图6设振元个数为n个，从左到右依次排列，tn为阵元n延时时间，θ为声束偏转角，d为阵元中心距，c为超声声速，可得相控阵超声声束偏转的延时法则为:

表1 引物序列

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造模方法：使用10%水合氯醛生理盐水溶液腹腔麻醉大鼠后，将大鼠双膝关节绒毛剃净，消毒皮肤表面，屈曲大鼠膝骨关节以便于触到外膝眼所在，确定进针点后，沿髁间窝方向进针，针头刺入皮肤表面后会有落空感，然后将木瓜蛋白酶推入，双侧膝关节腔分别注射4%木瓜蛋白酶0.2 mL。出针后按压针口约1 分钟，用酒精擦净血迹，最后将大鼠放回笼内常规饲养。于实验开始的第1、4、7 天重复操作。关节注射3 次后，使用动物实验跑台驱赶大鼠跑步1 周，每天20 min。

1.4.4 Western blot 检测TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表达将冻存与-80℃冰箱的滑膜组织取出备用，使用RIPA 裂解液将细胞裂解，按说明书步骤配制总蛋白溶液，再将滑膜组织匀浆。BCA 法测定蛋白质浓度。测完蛋白含量后，按照5 ∶1 的比例加入蛋白上样缓冲液，滚水煮约5 min。将样本配制于分离胶及浓缩胶中进行电泳，然后转移至PVDF 膜，室温下将膜脱色后，使用5%的脱脂牛奶封闭一小时，加入配制的稀释一抗（TBST 溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5%BSA），4℃过夜。洗膜后，再次加入稀释一抗室温下孵育30 min 后洗膜。用化学发光剂显影，获取图像，Image J 软件处理系统分析TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表达水平。以GAPDH 作内参对照，每个蛋白重复检测3 次。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验过程中无大鼠死亡，除为验证造模是否成功每组处死1 只大鼠外，余下大鼠每组9 只均完成所有干预治疗，进入结果分析。

1.4.2 干预方法 造模完成后的第1 天，进行推拿、灌胃给药治疗。推拿组将大鼠固定于大鼠固定器上，遵循《实验针灸学》[13]的取穴原则确定穴位所在，待大鼠平静后，于大鼠膝关节的内膝眼、外膝眼、血海、梁丘等穴行一指禅推法，以拇指前端精准接触穴位，频率控制约120 次/min，每穴推约2 min，最后屈伸膝关节10 次，结束治疗，每次总治疗时间约10 min，每天1 次。参照《药理实验方法学》[14]种属间等效剂量折算表，灌胃组予以塞来昔布24 mg/kg·d 灌胃，药物剂量：每天塞来昔布24 mg/kg 溶于生理盐水中配制成混悬液，定时给药，每天1 次。推拿加灌胃组予以上2种干预方式，每天1 次。

1.3.4 溶液配制 磷酸化蛋白酶抑制剂：每1 mL RIPA 试剂配制100 mM PMSF 10 μL，加蛋白酶抑制剂5 μL，加磷酸化蛋白酶抑制剂5 μL，混匀；30%丙烯酰胺（1 L）：BIS 10 g 配丙烯酰胺290 g，加入去离子水直至1 000 mL；TBS 缓冲液（1 L）：10 mL Na-Cl 8.8 g 配1 M Tris-HCl（pH=7.5），加入去离子水直到1 000 mL；转移缓冲液（2L）：甲醇400 mL 配甘氨酸28.8 g 配Tris 4.84 g 加入去离子水直到2 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制剂：每1 mL RIPA 试剂配制100 mM PMSF 10 μL、蛋白酶抑制剂5 μL，混匀；电泳缓冲液（2L）：2 g SDS 配37.54 g 甘氨酸配6.06 g Tris 加入去离子水直到2 000 mL。

2.3.1 TRAF6 mRNA 表达水平 与空白组相比，模型组、推拿组、灌胃组的TRAF6 mRNA 表达均上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），推拿加灌胃组与空白组相比TRAF6 mRNA 表达几乎无差异，稍上调（P>0.05）；与模型组相比，各治疗组TRAF6 mRNA 表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），且各治疗组TRAF6 mRNA 表达量：推拿加灌胃组＜推拿组＜灌胃组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

贵州9个地区土壤对Cd的吸附△Go<0，说明吸附反应可自发进行。在相同pH条件下，土壤对重金属的吸附量与初始浓度呈正相关；在不同pH条件下，土壤对重金属Cd的吸附量随pH升高而逐渐增大。

2.3.2 NF-ΚBp65 mRNA 表达水平 与空白组相比，模型组、推拿组、灌胃组的NF-ΚBp65 mRNA 表达均上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），推拿加灌胃组与空白组相比NF-ΚBp65 mRNA 表达几乎无差异，稍上调，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，各治疗组NF-ΚBp65 mRNA 表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），各治疗组NF-ΚBp65 mRNA 表达量：推拿加灌胃组＜推拿组＜灌胃组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图2。

图1 各组大鼠滑膜组织TRAF6 mRNA 表达水平

图2 各组大鼠滑膜组织NF-ΚBp65 mRNA 表达水平

表2 各组大鼠滑膜组织TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA的表达水平（s，n=9）

表2 各组大鼠滑膜组织TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA的表达水平（s，n=9）

注：与空白组比，*P＜0.05；与模型组比，#P＜0.05

2.4 各组滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表达水平与空白组相比，其余各组TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表达上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，其余各组TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），各治疗组TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表达：推拿加灌胃组＜推拿组＜灌胃组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图3。

小说《斗破苍穹》，主人公萧炎，从一开始的“废柴”，到最后肩负起家族复兴的重担，并逐步走向大陆巅峰，成为天才的故事告诉我们一个令我们受益终生的道理，那就是：只有靠自己的努力奋斗的人，才有可能实现自己的理想！小说本身所体现的精神与内涵，是一个属于不断奋斗的历史，是一段不断前行的历史。主人公有着绝强的性格，永不言败的精神，一路闯荡，一次又一次地创造不可思议的奇迹。

表3 各组大鼠滑膜组织TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表达水平（s，n=9，μmol/L）

表3 各组大鼠滑膜组织TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表达水平（s，n=9，μmol/L）

注：与空白组比，*P＜0.05；与模型组比，#P＜0.05

图3 各组大鼠滑膜组织TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表达水平（Western blotting）

3 讨论

随着对TLR4 研究的广泛深入，OA 患者组织中的TLR4 受到的关注逐渐增多。TLR4 是TLRs 家族中的一员，作为一类I 型跨膜蛋白受体[15]，它的激活可诱导很强的免疫反应，在天然免疫和炎症反应中发挥主要作用[16-17]。当TLR4 被激活后，TLR4 可以通过其下游的MyD88 依赖性信号转导通路来激活各种炎症因子。MyD88 是TLR4 信号通路中的关键接头分子之一，主要作用是传递上游信息，在疾病的发生发展中产生重要作用[18]。当激活TLR4-MD2-CD14 复合体之后，TLR4 与MyD88 Toll 结构相结合，接着产生一连串级联反应，再通过结合TRAF6 来激活IκB 激酶（IKK）复合体[19-20]。谈冰[10]等研究发现新风胶囊通过下调NF-ΚBp65、TRAF6 的表达水平，降低异常的炎症免疫反应，进而减轻膝骨性关节炎患者关节疼痛及僵硬症状。

肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）属于TRAFs 家族，相对分子量为60 kD，由530 个氨基酸组成[21]。TRAF6 直接或间接参与许多条滑膜组织炎症信号通路的活化过程，调控炎症因子的产生和释放，与破骨细胞的分化、存活及骨的重吸收等密切相关[22-23]。在炎症反应、骨代谢、细胞凋亡及应激反应等方面具有重要意义[24-25]。由表2 和表3 的可以看出：与空白组相比，其余各组TRAF6 mRNA 和蛋白表达均上调，说明和正常大鼠对比，膝骨性关节炎大鼠滑膜中的TRAF6 mRNA 和蛋白含量均是高表达的，该因子与膝骨性关节炎的发生相关；与模型组相比，其余各组TRAF6 mRNA 和蛋白表达均下调，说明各治疗组都能有效抑制了大鼠滑膜组织的TRAF6 表达，从而减轻炎症反应。从图1和图3 可以看出：各治疗组在与模型组相比TRAF6 mRNA 和蛋白表达均下调的同时，组间比较二者的表达也存在差异，且表达量都表现为：推拿加灌胃组＜推拿组＜灌胃组。这说明各治疗组在有效抑制了大鼠滑膜组织的TRAF6 mRNA 和蛋白表达方面，推拿组优于灌胃组，但推拿加灌胃组的效果更好。

口腔专业研究生规范化培训模式为理论课集中培训、临床见习和临床实习。目前，国家规定的规范化培训时间是3年，但有效的培训时间并不充足。其原因主要为：整个培训计划、培训内容和实施流程存在不足；碎片时间利用较差，因材施教的空间较少。以上因素导致了口腔专业研究生在规范化培训中操作技能的有效培训时间明显减少，进而降低了规范化培训的效率。

NF-κB 家族归属于Rel 蛋白家族，该家族共有5个成员，NF-κB1，NF-κB2、Rel A（p65）、Rel B 和c-Rel[26]，NF-κBp65 在炎症反应、免疫调节、细胞凋亡及肿瘤发生中起到重要的作用[27-29]。由表2 和表3 可以看出：与空白组相比，其余各组NF-κBp65 mRNA 和蛋白表达上调，说明较正常大鼠来说，膝骨性关节炎大鼠滑膜中的NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白含量均升高，该因子与膝骨性关节炎的发生相关；与模型相比，其余各组NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白表达均下调，说明各治疗组都能有效抑制了大鼠滑膜组织的NFΚBp65 表达，从而减轻炎症反应。从图2 和图3 可以看出：各治疗组在与模型组相比NF-κBp65 mRNA 和蛋白表达均下降的同时，组间比较二者的表达也存在差异，且表达量都表现为：推拿加灌胃组＜推拿组＜灌胃组，从而说明各治疗组在有效抑制了大鼠滑膜组织的NF-κBp65 mRNA 和蛋白表达方面，推拿组优于灌胃组，但推拿加灌胃组效果更好。

推拿疗法是医者运用特定的手法作用于患者体表；可以通过刺激穴位或痛点，达到活血止痛、疏经通络的作用[30]。一指禅推法为一指禅流派的经典治疗手法，具有操作简单，着力面积小，力量集中的特点，被广泛用于科研及临床[31]。胡炳麟[32]等研究发现一指禅推法能有效减轻膝关节骨性关节炎患者膝关节疼痛。本次实验使用一指禅推法作用于大鼠血海、梁丘、内膝眼、外膝眼4 穴，再配合膝关节屈伸法，以达到舒筋骨、利关节的目的。

随着高等教育的改革，地方师范院校培养中小学教师的使命被赋予了一种全新意义的综合性人才培养基地的标识，向着更为全面的综合性院校发展。教师资格证的统考和非师范院校的不断增加，加之大学生就业的严峻性和就业渠道的多样性，许多非师范生的学生选择了教师职业，而师范院校的学生却另辟蹊经，开创自己的求职创业之路。面对这种现状，地方师范院校的人才培养模式及教师的课堂教学方法、手段都要不断改革，既要凸显“师范性”，又要兼顾学生职业变化的需求，要使学生具备终身发展的能力及素养。

综上所述，推拿通过下调膝骨性关节炎大鼠滑膜组织TRAF-6、NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白的表达，减轻滑膜炎症反应，从而起到消炎止痛的作用，最终达到防治膝骨性关节炎的目的，这为推拿防治膝骨性关节炎的作用机制的临床研究提供一定的实验基础。