复方参鹿颗粒调节相对低危骨髓增生异常综合征患者TGF-β1 介导的Treg/Th17 细胞变化的临床研究*

陆颖佳，陈 珮，邱仲川，赵 琳，胡晓莹，朱小勤，瞿玮颖，封 舟，黄中迪

（上海中医药大学附属曙光医院血液科，上海200021）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病转化[1]。相对低危MDS 是其中向白血病转化的概率相对较低的部分患者，预后相对较好，主要表现为无效造血、难治性血细胞减少，目前此类患者无针对性治疗，以支持治疗、免疫调节、免疫抑制为主。研究发现Th17 细胞（T helper cell 17，Th17）的增高、Treg 细胞（T regulatory cells，Treg）的降低，及其比率的异常导致低危MDS 患者的自身免疫异常，导致血细胞降低[2-4]。TGF-β 是一种转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β），对Th17 细胞、Treg 细胞有调控作用。TGF-β1 是TGF-β 家族中的一个亚型，其与免疫系统相关，与Treg 细胞扩增有关，也是研究造血系统TGF-β 的主要对象。研究显示IL-6 和TGFβ1 可以活化Th17 细胞[5]，IL-2 和TGF-β1 可增强维持Treg 细胞[6]。我院自制制剂复方参鹿颗粒可以提高MDS 患者红细胞数量及血红蛋白含量，并可提高患者的CD4+、CD4+/CD8+比值、NK 数值，使CD8+数值下降[7]。为进一步了解复方参鹿颗粒对相对低危MDS 患者细胞免疫的影响，本研究检测复方参鹿颗粒治疗相对低危MDS 患者治疗前后TGF-β1、IL-2、IL-6、Treg细胞、Th17 细胞、Foxp3mRNA、RORγtmRNA 水平及相关比值，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取均来自上海中医药大学附属曙光医院血液科于2016 年5 月－2018 年6 月间住院收治者的骨髓增生异常综合征属相对低危患者40 例，其中男性18 例，女性22 例，中位数年龄43 岁（19～75岁）。随机分为2 组，中药组20 例，对照组20 例。中药组中男性10 例，女性10 例，中位数年龄45 岁（19～75岁）；对照组男性8 例，女性12 例，中位数年龄42 岁（23～68 岁），初发血象2 组患者性别、年龄均无明显差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：所有病例诊断均符合国内MDS 诊断标准[1]，并按照IPSS 积分标准分期，符合相对低危MDS（包括IPSS 评分的低危、中危-1），无严重心肺疾病及肝肾功能损害而能配合口服中药制剂者皆为纳入病例。中医辨证标准：中医肾阳虚证标准参照《中药新药临床研究指导原则》[8]中肾阳虚证的诊断标准制定。排除标准：①继发性MDS及MDS 合并有其它血液病或恶性肿瘤者；②有严重心肺疾病及肝肾功能损害者；③未按规定用药、无法判定疗效者。

1.3 治疗方法 对照组服用环孢霉素A（杭州中美华东制药有限公司，批号120932），3～6 mg/（kg·d），分早晚2 次口服，血药浓度维持在100～300 ng/L。中药组同时加用予复方参鹿颗粒（药用红参须、熟附子、肉桂、鹿角片、炙龟板、菟丝子等，本院院内制剂，沪药制Z06100005，参照《中华人民共和国药典》2000 版的要求制成冲剂，每包12 g，批号20120302），剂量：成人每次服用1 包，3 次/d，2 组治疗均以6 个月为1个疗程，共1 个疗程。必要时予输血支持治疗；感染者予抗感染治疗。本试验经过我院伦理委员会批准，并取得所有研究对象的知情同意。

1.4 检测方法

1.4.1 外周血Treg 细胞检测 分别于治疗前后采集外周血，应用荧光免疫直接标记法及FCM 检测外周血CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞。加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PE 各20 μL，振荡混匀，室温避光孵育20 min 后，每管各加入250 μL 的Cytofix/Cytoperm 液，室温避光20 min，380×g 离心5 min，弃上清液，加入PBS 液1 mL，1 500 r/min 离心10 min，弃上清液，加入PBS 液1 mL 混匀后，应用FAC-Station流式细胞仪对每管标本采集个细胞进行分析，使用美国BD 公司的Celquest 软件，以CD4+细胞设门来分析CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞所占的百分比。

1.4.2 外周血Th17 细胞检测 分别于治疗前后采集外周血，调节细胞浓度为2×106细胞/mL。加入CD3-PerCP、CD4-PE-cy7 各20μL，混匀，室温避光孵育15～20 min。加入Cytofix/Cytoperm 液250 μL，室温放置20 min。加入Perm/Wash 液1 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清，清洗2 次，用50 μL Perm/Wash液重悬A、B 管。实验管A 中加入BD IL-17A-PE 20 μL，避光孵育30 min。加入Perm/Wash 液1 mL 洗涤2 次。最后以300 μL Staining Buffer 染色缓冲液重悬细胞。采用Cellquest 软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3 和CD4 散点图设门区分Th 细胞（CD3+CD8-）。以IL-17A 的曲线图表示Th17 细胞，计算IL-17A+Th17 细胞在CD3+CD8-T 细胞中的比率。

1.4.3 外周血Foxp3 mRNA、RORγt mRNA 检测 提取TotalRNA 后，逆转录后，进行荧光定量PCR，反应条件：95 ℃30 sec 1 个循环、95 ℃5 sec，60 ℃34 sec 持续共40 个循环→95 ℃15 sec，60 ℃1 min，95℃15 sec。最后读取目的基因与内参基因CT 值，计算2-△CT 值统计。各基因引物序列如下：

RORγt F：5'-CTGCAAGACTCATCGCCAAAG-3'；

RORγt R：5'-TTTCCACATGCTGGCTACACA-3'；

Foxp3 F：5'GGGTAGCCATGGAAACAGCA-3'；

Foxp3 R：5'TCGCATGTTGTGGAACTTGAAGTAG-3'；

β-actin F：5'AAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'；

β-actin R：5'TGTGTGGACTTGGGAGAGG-3'；

1.4.4 外周血TGF-β1、IL-2、IL-6 检测 TGF-β1、IL-2、IL-6 均用ELISA 双抗体夹心法检测，具体操作按照试剂盒提供的说明书进行。

1.5 统计方法 采用SPSS17.0 统计软件对数据进行统计学分析，符合正态分布和方差齐性的计量资料采用均数±标准差（s）表示，不符合正态分布的计量资料采用中位数表示。计量资料采用t 检验；不符合正态分布的计量资料和计数资料采用秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Treg 细胞表达、Th17 细胞表达，Treg/Th17 比值比较 中药组治疗前后Treg 细胞表达、Treg/Th17 比值低均有明显差异（P＜0.05），对照组治疗前后无明显差异（P>0.05）。治疗前中药组与对照组的Th17 表达、Treg 表达，Treg/Th17 比值均无明显差异（P>0.05）；治疗后中药组Th17 细胞无明显差异（P>0.05），Treg 细胞表达与Treg/Th17 比值均高于对照组，组间比较有明显差异（P＜0.05）。见表1。

表1 2 组治疗前后Treg 细胞表达、Th17 细胞表达变化，Treg/Th17 比值变化比较

2.2 外 周 血 RORγt、Foxp3mRNA 表 达、Foxp3/RoRγt mRNA 比值比较 中药组治疗后RORγt mRNA 表达上升，无明显差异（P>0.05）、Foxp3mRNA 表达、Foxp3/RoRγt 比值检测均有所提升，较治疗前有明显差异（P＜0.05）；对照组治疗后RORγt mRNA 表 达、Foxp3mRNA 表 达、Foxp3/RoRγt 比 值检测较治疗前有所上升，无明显差异（P>0.05）。治疗前中药组与对照组的Foxp3mRNA、RORγt mRNA 表达、Foxp3/RoRγt 比值无明显差异（P>0.05）；但治疗后中药组Foxp3mRNA 表达、Foxp3/RoRγt比值检测均高于对照组，组间比较有差异（P ＜0.05）。见表2。

表2 治疗前后RORγt、Foxp3mRNA 表达、Foxp3/RoRγT 比值变化

2.3 外周血TGF-β1、IL-2、IL-6 及IL-2/IL-6 比值检测结果比较 组内治疗前后比较：中药组治疗后IL-2 表达上升，无明显差异（P>0.05）；IL-6 表达下降，较治疗前有明显差异（P＜0.05）；TGF-β1、IL-2/IL-6 比值上升，较治疗前有明显差异（P＜0.05）。对照组治疗后TGF-β1、IL-2 表达与治疗前比较有所上升，但无明显差异（P>0.05），IL-6 比值检测较治疗前有所下降，无明显差异（P>0.05）；IL-2/IL-6 比值上升，较治疗前有明显差异（P＜0.05）。中药组与对照组的组间比较：中药组与对照组的治疗前均无明显差异（P>0.05）；但治疗后中药组TGF-β1、IL-2/IL-6 比值均高于对照组，组间比较有明显差异（P＜0.05）；IL-6 表达低于对照组，组间比较有明显差异（P＜0.05）。见表3。

表3 2 组治疗前后TGF-β1、IL-2、IL-6 及IL-2/IL-6 比值检测结果比较

3 讨论

相对低危MDS 患者主要以无效造血、难治性血细胞减少为主要表现，虽然向白血病转化的概率相对较低，然而研究显示相对低危MDS 预后较差的因素有血小板减少、需要输血的贫血、老年、较高的骨髓原始细胞、和预后差的染色体核型[9]，贫血是患者的生存质量相关的主要因素，输血依赖的患者医疗费用也增加[10-11]。改善造血、提高生活质量是相对低危MDS患者的首要目标。

复方参鹿颗粒是有我院血液科创始人吴翰香老先生在多年的临床实践总结得出的经验制剂。吴老认为治疗应根据MDS 病情程度，发病具有异质性的特点，采取辨证辨病相结合进行治疗，MDS 发病机制是“精髓亏乏，气血双亏是为本，邪毒内蕴相兼，正邪消长为轴”[12]，而相对低危MDS 患者在正邪消长中以精髓亏乏、气血双亏为主。从中医理论分析，肾主骨生髓，肾精不足则髓不生血，故吴老先生将以温肾益髓为治疗大法的复方参鹿颗粒用于相对低危MDS，方中重用红参须、鹿角片、附子、肉桂、菟丝子、肉苁蓉、补骨脂温阳益气；熟地黄、龟甲、枸杞子滋补肾阴；阴阳双补，以填精生髓。既往临床研究总结表明，复方参鹿颗粒具有提高相对低危MDS 患者红细胞数量、血红蛋白含量，其总有效率为85%，优于对照组；同时，发现其有改善T 细胞免疫功能的作用，可提高患者的CD4＋，CD4＋/CD8＋比值，NK 数值，使CD8＋数值下降，并与其改善患者贫血程度相关[7]。

研究表明[13]在MDS 早期阶段，免疫紊乱和自身免疫可能导致无效造血系统和骨髓造血失败。Th17细胞可以触发免疫紊乱的应答。循环Th17 细胞的扩增占主导地位，支持炎症自身免疫最终导致骨髓的细胞凋亡[3]，IL-17 和IL-17 受体的mRNA 在低危MDS患者较高危和正常组增高，增高的IL-17 与严重贫血有关[14]。低危MDS 患者的Treg 细胞的分布更低，因此导致针对发育不良的克隆的自身免疫反应。低危患者Treg 细胞水平低，更多地表现为异常红系造血[15]。Treg 细胞的数量在输血依赖的病人中比无输血依赖的人更低[2]。低危患者更高Th17/Treg 率是与细胞凋亡率正相关[4]。CD8+细胞毒性T 细胞和数量减少的Treg 细胞在低危MDS 患者中是互相关联的[15]。

研究显示，低危MDS 患者的MSC 相比正常的MSC 分泌更多的IL-6，更少的TGF-β1[16]。IL-2 是Treg 细胞的一个决定性的细胞因子，与TGF-β 联合在推动Treg 细胞的功能和稳态[6]。MDS 中IL-2 活性降低，提示免疫力低，与病情预后相关[17]。

此次研究显示，治疗后中药组TGF-β1、IL-2/IL-6 比值、Treg 细胞表达、Treg/Th17 比值、及Foxp3mRNA 表达、Foxp3/RoRγt 均较对照组有所提高，IL-6 表达较对照组下降，且与治疗前有明显差异，提示复方参鹿颗粒对TGF-β1、IL-2/IL-6、Treg 细胞表达、Treg/Th17 比值及其功能蛋白Foxp3mRNA 表达、Foxp3/RoRγt 比值有一定调控作用，并可能通过调控两者平衡来改善血象。

有文献报道，Treg 细胞绝对数的升高与贫血、血红蛋白降低、原始细胞升高相关，向高危发展[18]，高比例的Treg 细胞与生存较差的相对低危MDS 患者相关[19]，早期MDS 患者出现CD4+CD25high+CD127lowTreg细胞增高[20]，作为保护性机制导致的免疫过亢引起的细胞过度凋亡与自我免疫抑制引起的肿瘤逃逸这一矛盾，尚无有效的解决方案，然而在临床治疗中免疫抑制治疗有一定的疗效。

有研究认为，TGF-β1 是一个骨髓抑制的细胞因子，TGF-β1 血浆水平在MDS 患者中增高，与其造血抑制有关[21]，TGF-β1 与IL-6 促进Th17 细胞分化[5]，IL-6 减少Foxp3[22]，MDS 患者中IL-6 亦增加[23]，TGFβ1 的抑制造血作用是否与IL-6 增加，导致Treg 细胞降低有关。而我们在复方参鹿颗粒治疗随访中并未出现与其治疗相关的血象恶化或向高危发展的倾向，而TGF-β1 在体内抑制骨髓和促进Treg 细胞分化启动的有效浓度折点是多少，其与MDS 恶性克隆基因是否存在相关性均有待进一步研究。