复方鳖甲软肝片对肝纤维化大鼠的保护作用及其机制*

孙振亮，吴 哲，贵襄平，田凌云，李先鹏

（1. 湖北省保康县人民医院感染科，湖北 保康441600；2. 湖北中医药大学附属襄阳医院肝胆病科，湖北 襄阳441000；3.宁波市鄞州人民医院肝病科，浙江 宁波315040）

肝纤维化既是慢性肝病的结果，同时也是肝硬化发病的必经阶段，因此，对于肝纤维化的防治，可有效延缓慢性肝病的进展并改善患者临床预后[1-2]。复方鳖甲软肝片是临床上肝纤维化防治的复方制剂，对于早期肝硬化具有明显的阻断作用[3-4]。目前相关动物研究证实，复方鳖甲软肝片可显著改善CCL4肝纤维化大鼠肝组织炎症程度以及大鼠的肝纤维化程度，但是对于其具体的作用机制，目前尚无统一认识[5]。为进一步了解复方鳖甲软肝片对肝纤维化大鼠作用机制，本研究探讨复方鳖甲软肝片对肝纤维化大鼠的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择清洁级SD 雄性大鼠30 只，体质量（250±10）g，购于重庆国家生物产业基地实验动物中心，实验动物使用许可证SYXK（渝）2017-0023。

1.2 主要试剂及仪器 复方鳖软肝片，购于内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司，国药准字Z19991011；IV 型胶原（CIV）、透明质酸（HA）以及层粘连蛋白（LN）ELISA 试剂盒均购于北京北方生物技术研究所；CCL4 购于上海凌峰化学试剂有限公司；丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBil）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）试剂盒购于深圳迈瑞生物医疗股份有限公司；兔抗COX-2 多克隆抗体购于美国Noemarkers 公司；鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体购于武汉博士德生物技术有限公司。BSA124S 电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；台式高速冷冻离心机（Heal Force 公司）；全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技有限公司）；酶标仪（美国Bio Tek 仪器有限公司）；倒置荧光显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司）。

1.3 方法 将30 只大鼠随机分为3 组，分别是对照组、模型组、药物组，每组各10 只。其中模型组、药物组使用橄榄油配制40% CCL4，进行皮下注射造模，注射剂量3 mL/kg，每周2 次，首次注射剂量加倍，连续注射6 周；对照组大鼠使用等容量橄榄油皮下注射。造模同时，药物组大鼠给予1 g/kg·d-1复方鳖甲片灌胃（磨成粉末后用生理盐水配制），而对照组、模型组每天给予等容量生理盐水灌胃，灌胃均为6 周。各组大鼠均自由饮水，使用标准饲料饲养。

末次给药后，禁食不禁水12 h，抽取大鼠腹主动脉血，离心5 min（3 000 r/min），分离血清置于-80 ℃冰箱内保存待测，使用全自动生化分析仪检测大量肝功 能 指 标ALT、AST、T-Bil、ALB、TP 水 平；采 用ELISA 法检测大鼠纤维化指标HA、CIV、LN 水平。

取各组大鼠部分肝组织，使用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，采用免疫组化法检测大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表达情况。评价标准：COX-2蛋白阳性染色主要表现为细胞膜和/或细胞浆呈棕黄色着色；α-SMA 蛋白阳性表达主要表现为细胞浆呈棕黄色表达。根据蛋白表达程度以及着色阳性细胞范围评分。阳性程度：0 分：不着色；1 分：着色淡；2 分：中等着色；3 分：着色深。阳性细胞范围：0 分：无着色；1 分：着色阳性细胞数＜30%；2分：着色阳性细胞数在30%～50%之间；3 分：着色阳性细胞数>50%。蛋白表达积分为着色程度以及阳性细胞数得分之和。

1.4 统计学分析 采用统计学分析SPSS 22.0 进行数据处理分析，计量资料比较采用t 检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝功能指标比较 模型组、药物组ALT、AST、T-Bil 水平较对照组显著升高（P＜0.05），但药物组ALT、AST、T-Bil 水平明显低于模型组（P＜0.05）；而模型组、药物组ALB 较对照组显著降低（P＜0.05），但药物组ALB 水平明显高于模型组（P＜0.05）；3 组TP 水平无显著差异（P>0.05），见表1。

表1 各组大鼠肝功能指标比较（

表1 各组大鼠肝功能指标比较（

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

2.2 各组大鼠纤维化指标比较 模型组、药物组HA、CIV、LN 水平较对照组显著升高（P＜0.05），药物组HA、CIV、LN 水平明显低于模型组（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠纤维化指标比较（s，U/L）

表2 各组大鼠纤维化指标比较（s，U/L）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

2.3 各组大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表达情况比较模型组、药物组COX-2、α-SMA 蛋白表达较对照组显著升高（P＜0.05），药物组COX-2、α-SMA 蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表达情况比较（，分）

表3 各组大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表达情况比较（，分）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

3 讨论

肝纤维化是一切慢性肝病，如血吸虫病、酒精性肝病、病毒性肝炎的共同病理基础，是慢性肝病发展至肝硬化的必经过程，同时与肝癌的发生也具有着一定的关系[6-7]。对于肝病的肝纤维化阶段，若采取恰当的治疗方案，可有效逆转肝纤维化进程，并促进肝病的恢复，因此，采取有效的抗纤维化药物对于控制肝病的发展具有临床意义[8]。根据慢性肝病的病因病机及患者临床表现，可将肝纤维化归属于中医学“积聚”“癥瘕”“胁痛”等范畴。肝纤维化因湿、热、痰、瘀、毒、郁等作用，导致机体正气不足，邪毒留滞于肝，从而导致脉络瘀阻、气机郁滞，因此临床治疗应以疏肝活血、软坚散结为治疗原则[9]。复方鳖甲软肝片有党参、三七、鳖甲、当归、板蓝根等药物组成，具有化瘀解毒、软坚散结、益气养血之功效[10-11]。本研究采用CCL4诱导肝纤维化，同时使用复方鳖甲软肝片进行干预治疗，分析复方鳖甲软肝平对肝纤维化大鼠的保护作用及其机制。

研究显示[12-13]，采用CCL4诱导大鼠肝纤维化模型，CCL4诱导产生过量的自由基可引发肝细胞膜脂质过氧化，诱导释放大量炎性因子使干细胞的损伤，肝细胞内转氨酶ALT、AST 水平显著升高，引起蛋白质合成代谢功能降低。模型组、药物组大鼠ALT、AST、T-Bil 水平较对照组显著升高（P＜0.05），药物组大鼠ALT、AST、T-Bil 水平 明 显 低于 模 型组（P ＜0.05）；而模型组、药物组大鼠ALB 较对照组显著降低（P＜0.05），但药物组大鼠ALB 水平明显高于模型组（P＜0.05）。与相关研究结果相似[14]，采用CCL4诱导大鼠肝纤维化模型，可造成大鼠肝功能损伤以及白蛋白水平的降低，而采取复方鳖甲软肝片干预后，可有效降低大鼠肝功能损伤，从而对肝纤维化大鼠具有着良好的肝功能保护作用。目前临床上常用的肝纤维化血清标志物主要由HA、CIV 以及LN，研究显示，HA、CIV、LN 水平与肝纤维化程度呈显著正相关关系。本研究结果显示，模型组、药物组大鼠HA、CIV、LN 水平较对照组显著升高（P＜0.05），但药物组大鼠HA、CIV、LN 水平明显低于模型组（P＜0.05）。提示CCL4可有效诱导大鼠肝纤维化的发生，而采取复方鳖甲软肝片干预，可有效阻止肝纤维化进程，减轻大鼠肝纤维化病情。

COX-2 是前列腺素合成酶亚型，主要在炎症因子以及细胞因子刺激下表达，可促进前列腺素合成，引起微血管障碍而引起血管内皮损伤，启动机体炎症级联反应，参与机体多种组织以及细胞炎症反应当中[15]。研究显示[16]，在CCL4诱导慢性肝损伤大鼠肝纤维化进程中，可表现出COX-2 蛋白表达的显著增加，且随着肝纤维化严重程度的加剧而增加。此外，α-SMA 蛋白的表达与肝星状细胞（HSC）活化有关，参与到了肝纤维化的发生发展过程当中[17-18]。研究分析复方鳖甲软肝片干预对肝纤维化大鼠COX-2、α-SMA 蛋白表达的影响，结果显示，模型组、药物组COX-2、α-SMA 蛋白表达较对照组显著升高（P＜0.05），药物组COX-2、α-SMA 蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05）。提示复方鳖甲软肝片干预对肝纤维化大鼠肝功能保护作用、延缓肝纤维化疾病进程，其可能机制与抑制肝组织COX-2、α-SMA 蛋白表达有关。