五谷麒麟膏调控Bcl-xl/Bak 促进肛瘘术后创面愈合机制研究*

苗 咪，冯文哲，阴新元，柴小琴，朱建东

（1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳712000；2. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳712000）

肛瘘，中医称之为“肛漏”，是指肛管、直肠与肛门周围皮肤之间所形成的异常通道，目前关于其发病机制说法较多，但大众较为认可的学说是由于肛窦感染引起，其为肛痈未及时处理或处理不当所致[1]。肛瘘自愈较为困难，为临床极其常见、多发的肛肠疾病，尤其以男性居多[2]。古代医家认为漏病的病因有三：一是由痔形成，二是漏病多由痈溃后形成，三是久咳引起[3]。明代《永类铃方》首创挂线疗法治疗肛瘘，说明自古以来手术就是肛瘘的主要治疗方法。肛瘘发病多因湿热邪毒而引起，湿与热滞留于术后创面，阻碍气血运行，而导致创面难以愈合，此乃肛瘘创面不易愈合的病因病机[2]。因而寻求一种能够有效的促进术后创面愈合的方法显得尤为重要。肛瘘术后外治法主要是基于化腐生肌理论的治疗。如果伤口分泌物较少，肉芽生长缓慢，则主要以“煨脓长肉”法为主。煨脓长肉法是中医外科的特色疗法，目前在临床上常用来治疗一些慢性难愈性创面[4]。本课题将“煨脓长肉”理论作用下拟定的五谷麒麟膏应用于促进SD 大鼠肛瘘创面模型愈合的实验研究，扩大了“煨脓长肉”法的运用范围，我们以细胞凋亡为切入点，通过Bcl-xl、Bak蛋白表达水平，从分子水平论述五谷麒麟膏促进创面愈合的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 120 只雄性SPF 级SD 大鼠，体质量20～150 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（陕）2017-003。饲养于陕西中医药大学医学实验动物中心。饲养温度：20～25 ℃，相对湿度：40%～60%。实验期间，动物可以自由饮水并喂养普通饲料（西安交通大学医学部实验动物中心提供）。按完全随机法随机分为6 组：模型组20 只、京万红阳性对照组20 只、五谷麒麟膏高、中、低药物浓度组20 只，另设20 只为正常对照组。适应性喂养2 周，待体质量达80～200g 左右后开始实验。

1.1.2 药物与制剂 五谷麒麟膏组分为：五谷虫30 g、血竭（又名血麒麟）30 g、紫草15 g、蛋黄油、麻油等。制备所需中药均来自陕西中医药大学附属医院中药房。制作方法先将五谷虫粉、紫草俩两味入混合油内浸3d，然后文火熬枯去渣。再入血竭化尽，次入白蜡微火化开，待油温后，再入研细轻粉搅匀，冷却后即凝成膏。五谷麒麟膏含药剂量分组：五谷麒麟膏低浓度组：10%浓度；五谷麒麟膏中浓度组：20%浓度；五谷麒麟膏高浓度组：40%浓度。京万红软膏采用由天津达仁堂二药业有限公司生产。凡士林采用商丘市伟康医用品厂生产的白凡士林，每瓶400 g。

1.1.3 试剂与实验仪器 Bcl-xl 试剂盒（货号2764 s，购自CST）；Bak 试剂盒（货号bs-1284R，购自Bioss）；苏木素试剂盒（货号H9627，购自Sigma）；伊红Y（水溶性）试剂盒（货号71014544，购自国药集团）；脱水机（武汉俊杰JT-12J 电脑生物组织脱水机）；蜡块包埋机；病理切片机（德国Leica RM 2016轮转式切片机）；切片刀（日本羽毛R35 一次性刀片）；组织摊烤片机（武汉俊杰JK-6 生物组织摊烤片机）；载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；显微镜（奥林巴斯BX53 型生物显微镜）；抗原修复用电陶炉（SKG）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 采用付小兵等方法制造污染性伤口愈合的动物模型，制造模拟肛瘘术后创面的动物模型[5-6]。将实验组、京万红组、模型组大鼠背部手术区域备皮，并用5%水合氯醛溶液（0.007 mL/g）腹腔注射麻醉，碘伏棉球常规消毒，剪去边长为3.0 cm 大小方形皮肤，破坏皮肤全层及皮下浅筋膜直至肌层，止血后将大鼠粪便混悬液淋洒在伤口表面。创面部位敷以创面相应大小的油纱敷料，用纱布包扎以止血，24 h 后去除覆盖物。每日伤口淋洒粪便混悬液，72 h 后见伤口有脓性分泌物，渗液较多，创缘皮色发红，即造模成功。此时创面为一个“急性、开放、渗血、感染”创面，类似于临床肛瘘术后的创面。

1.2.2 给药方法 制作伤口模型成功后，模型组大鼠的创面外敷凡士林0.2 g；阳性药物京万红组外敷京万红0.2 g；治疗组五谷麒麟膏高、中、低浓度各组分别外敷五谷麒麟膏高、中、低浓度药膏，每个创面0.2 g，分组喂养。每日下午定时换药1 次，正常对照组常规饲养，未做任何治疗。

1.2.3 取材 用药后3 d、7 d、11 d、15 d，用透明薄

膜紧密敷贴于创口上，用较细记号笔画出伤口的边缘，然后将透明薄膜平铺在ECG 纸上，计算出创面面积数值（cm2）[7]。在无菌条件下取创面中心至创缘正常皮肤间的新生肉芽组织，洗去表面血液然后固定于10%中性福尔马林溶液。后经过脱水、透明、石蜡包埋制成蜡块，并连续4 um 切片以备后期使用。

1.2.4 检测指标和方法 一般情况：每次换药时，通过目视检查记录大鼠生命体征和伤口，包括大鼠的喂养和活动情况，伤口的颜色和质地，及渗液、周围组织水肿、痂皮等情况[8]。

创面愈合率：第n 天伤口愈合百分比（%）=（原始伤口面积-第n 天伤口面积）/原始伤口面积×100%[9]。在术后第3、7、11、15 天测量并记录伤口面积大小，并计算伤口愈合百分比。其中术后第1 天的伤口面积为原始伤口面积。

创面组织学观察：将切好的蜡片常规HE 染色后光学显微镜观察新生毛细血管数。

免疫组化检测Bcl-xl/Bak 比值：采用免疫组化SAP（碱性磷酸酶法）方法进行免疫组化染色。光学显微镜下拍照后用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件半定量分析Bcl-xl 及Bak 的值，然后计算Bcl-xl/Bak比值。

细胞凋亡率：采用TUNEL 法进行染色。光学显微镜下拍照后用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件定量分析细胞凋亡数及细胞总数。第n 天细胞凋亡率（%）=细胞凋亡数/总细胞数×100%。

1.3 统计学方法 实验数据用SPSS24.0 统计分析软件处理。所有实验数据均为计数资料。计数资料数据采用均数±标准差）表示多组间样本均数比较用方差分析，两两比较用配对t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 造模后当天各组大鼠进食较少，此后各组大鼠进食均有所增加，3-10 d 京万红组及实验组各大鼠的进食及活动情况均优于模型组；3-7 d 实验组各大鼠创面肉芽新鲜红活，局部渗液较多，京万红组大鼠创面颜色淡红，伤口渗液较多，模型组大鼠创面颜色淡白，局部渗液较少；7-15 d各组大鼠创面开始结痂，分泌物逐渐减少，其中实验组大鼠伤口痂皮较厚，范围较大，京万红组次之，模型组较差。正常组无阳性症状。

2.2 各组大鼠不同时期创面愈合率比较 创面愈合率可直接反映大鼠伤口愈合程度，进而反映不同药膏对大鼠创面愈合的影响。实验结果表明，实验组及京万红组大鼠创面愈合率均优于模型组，且高浓度组愈合率优于中浓度组，中浓度组优于京万红组与低浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05），京万红组与低浓组间无明显差异，差异无统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠不同时期创面愈合率比较（

表1 各组大鼠不同时期创面愈合率比较（

注：与模型组相比，aP＜0.05；与京万红组相比，bP＜0.05；与低浓度组相比，cP＜0.05；与中浓度组相比，dP＜0.05

2.3 创面组织学观察在伤口愈合过程中，肉芽组织形成和伤口收缩是创面愈合的重要环节。肉芽组织主要由毛细血管、炎症细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞所组成[8]。组织切片后常规HE 染色，通过观察400 倍镜下新生毛细血管数量可判断创面肉芽组织生长情况，间接反映不同药物促进创面愈合的程度。见图1。

图1 用药后11d 各组大鼠创面新生毛细血管数量

2.4 Bcl-xl/Bak 比值 模型组大鼠创面肉芽组织中Bcl-xl 及Bak 蛋白表达均低于阳性对照组及实验组，且Bcl-xl/Bak 比值最高差异有统计学意义（P＜0.05）；高浓度组Bcl-xl 及Bak 蛋白表达最高，Bcl-xl/Bak 比值最低，中浓度组次之，低浓度组高于中浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。低浓度组与京万红组无明显差异，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、图2。

表2 各组大鼠不同时期创面肉芽组织中Bcl-xl/Bak 比值

注：与模型组相比，aP＜0.05；与京万红组相比，bP＜0.05；与低浓度组相比，cP＜0.05；与中浓度组相比，dP＜0.05

图2 用药后11d 大鼠创面Bcl-xl 及Bak 表达情况

2.5 细胞凋亡率 用药后第3 d 各组大鼠创面细胞凋亡率无明显差异；第7、11 d 细胞凋亡率明显增加，其中第11 d 凋亡率达到最大，且实验组均高于模型组；第15 d 各组细胞凋亡率降低，且实验组凋亡率低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。低浓度组与京万红组无明显差异。见表3、图3。

表3 各组大鼠不同时期细胞凋亡率比较，%）

表3 各组大鼠不同时期细胞凋亡率比较，%）

注：与模型组相比，aP＜0.05；与京万红组相比，bP＜0.05；与低浓度组相比，cP＜0.05；与中浓度组相比，dP＜0.05

图3 用药后11 d 大鼠创面Bcl-xl 及Bak 表达情况

3 讨论

肛瘘是肛管直肠与肛门周围皮肤之间的异常通道，也称为肛管直肠瘘[10]。由于其特殊的病变部位和病理改变，肛瘘多需手术治疗。肛瘘术后创面一般为开放性伤口，易受粪便污染，因此伤口愈合缓慢是临床中较为棘手的问题[9]。中医药在创面愈合方面有着独特的优势，尤其对创伤后期的愈合起着十分显著的作用[11]。因此，开发能加速创面修复及缩短愈合时间的药物具有重要的临床及社会价值。

中医药在促进伤口愈合方面有着悠久的历史。早在战国时期的《周礼·天官》就已有记载：“疡医掌肿疡、溃疡、金疡、折疡”，说明此时的疡医已经掌握了治疗疮疡的方法，如理气、活血、解毒、利湿中药内服，结合去腐生肌等中药外用。关于“煨脓长肉”的讨论，首次出现在申斗垣《外科启玄·明疮疡宜贴膏药论》中：“在凡疮毒已平，脓水来少，开烂已定，…至此强壮诸疮，岂能致于败坏乎？”[12]。五谷麒麟膏是我们在前期“煨脓长肉”法理论研究的基础上，经过查阅大量的相关文献以及结合我们的临床经验所研制的外用油膏[13]。主要成分有：五谷虫、血竭、紫草等。五谷虫，味咸，性寒，归脾、肺经，现代药理研究认为五谷虫具有抑菌、抗炎、促进创面愈合等作用，临床可用于创面愈合，关节炎等[14-15]。血竭，又名血麒麟，味甘、咸，性平，归心、肝经，现代医药研究发现血竭主要含有黄烷类、三萜类等成分，包括：血竭红素和血竭素等，它具有止血、镇痛、促进组织愈合等药理作用[16]。紫草，味甘、咸，性寒，归心、肝经。紫草中含有萘醌类，单萜苯酚及苯醌类等多种化学成分，其药理作用主要体现在促进伤口愈合、抗流感病毒、抗肿瘤、抗癌等方面[17]。

创面愈合是人体内一系列正常的病理生理过程，是指组织因创伤或其他原因而受损或离断，局部组织通过再生、重建得到修复[18]。该过程由主要有炎症细胞、修复细胞、细胞外基质以及多种细胞因子共同参与并互相调控而完成[19]。细胞增殖在创面愈合过程中的作用已被研究得深入且透彻。目前，细胞凋亡在创面愈合方面是研究的热点话题。细胞凋亡是生命的基本现象，是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。细胞凋亡是多基因参与、控制的过程，包括Bcl-2 家族、Caspase 家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53 等，这些基因在种属之间非常保守。其中凋亡相关蛋白中的Bcl-2 家族是细胞凋亡的关键调节因子，其抗凋亡和促凋亡成员协同作用，发挥着细胞凋亡“开关”的作用。在众多凋亡途径中，线粒体途径是主要的内在途径，在此途径中Bcl-2 家族起着相当重要的作用。Bcl-2 家族分2 类，其中凋亡抑制基因有Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-W 等，凋亡促进基因有Bax、Bak、Bcl-Xs、Bax、Bik/Nbk、Bid 等[20]。Bcl-xl/Bak 的比值决定组织受到创伤后组织修复的快慢。此值越小则细胞趋于存活，创面愈合越快；值越大则细胞趋于凋亡，创伤修复较慢[21]。本实验创面肉芽组织中Bcl-xl/Bak>1，且高浓度组的比值最低，中浓度组次之，低浓度组高于中浓度组，低浓度组与京万红组无明显差异，说明高浓度组创面愈合最快，模型组最慢，故该药膏可加速创面的愈合，且以高浓度组最优。

本次研究结果表明，实验组大鼠创面中Bcl-xl及Bak 的表达均高于模型组，且Bcl-xl/Bak 比值优于模型组。由此表明五谷麒麟膏能通过调控创面肉芽组织中Bcl-xl/Bak 的表达，抑制创面肉芽组织细胞的过度凋亡，加速各创伤细胞的修复，进而对创面愈合发挥治疗作用。该油膏具有缓解止痛、止血、促进伤口愈合的良好效果。可以将五谷麒麟膏用于临床肛瘘术后创面促愈，并且有较好的推广应用前景。