生地提取物对肺纤维化大鼠血气分析影响及抗纤维化机制研究*

张 兴，陈 麒，张一乐，宋秀明，刘鲁炯，徐贵华，张艺宝，张 炜

（上海中医药大学附属曙光医院，上海201203）

肺间质纤维化属于炎症性疾病，病变常累及肺泡上皮细胞、肺间质等[1]，是一种进行性、致死性的肺纤维化疾病[2]，其发病机制尚未明确[3]，有效的治疗手段亦未被明确[4-5]。肺间质纤维化已成为呼吸系统领域研究公认的难点和热点。中医药治疗肺间质纤维化的研究近年来广受关注[6-10]，为肺间质纤维化的治疗提供了参考。

现代研究表明，生地的主要成分是梓醇等苷类成份、糖类和多种氨基酸等，生地的药理作用包括调节免疫功能、抗氧化损伤等[11]。我们前期研究[12-13]发现生地注射液可减轻肺纤维化模型动物肺泡炎及肺纤维化程度，并能改善胶原代谢和对氧自由基的清除能力；还证实生地对肺纤维化干预可能是通过转化生长因子-β1（TGF-β1）表达，从而减轻Ⅲ型胶原（Col Ⅲ）的异常沉积这一途径而发挥作用。前期临床研究[14]还发现生地注射液能改善肺纤维化患者的主要症状，提高血氧分压、血氧饱和度和6 min 步行距离。

本研究采用博莱霉素气管内注入法制作大鼠肺纤维化模型，重点探究生地提取物对肺纤维化大鼠血气分析、肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及干扰素-γ（IFN-γ）指标的影响情况，以研究生地对肺纤维化的治疗作用及其可能的机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性SD 大鼠216 只，体质量（200±5）g，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司（合格证编号2016000577159），饲养于上海中医药大学附属曙光医院动物实验中心。

1.2 药物及试剂 生地提取物（10 mL/支，2 g 生药/mL，生地水煎醇提物，上海中医药大学附属曙光医院中药制剂室，批号160910）；甲强龙粉剂（注射用甲泼尼松龙琥珀酸钠，40 mg/支，法玛西亚·普强公司卡拉玛祖分厂，批号160JTB）；注射用盐酸博莱霉素（Bleomycin）（15 mg/支，日本化药株式会社，批号J162310）；盐酸氯胺酮注射液（50 mg/mL，上海中西药业股份有限公司新冈制药厂，批号160408）；地西泮注射液（5 mg/mL，上海旭东海普药业有限公司，批号160501）；肝素钠注射液（6250 单位/mL，中国江苏常州生化千红制药有限公司，批号160512）；TNF-α 检测试剂盒（晶美生物工程有限公司）；IFN-γ 检测试剂盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3 实验仪器 轮转切片机（Leizi Jung RM 2035 Germany）；显微镜（Olympus BX-6 Japan）；血液气体分析仪（Roche OMNI modular system）；生化分析仪（Abbott Aeroset）；免疫酶标仪（Labsystems Dragon Wellscan MK3）；722 分光光度计（上海第三分析仪器厂）。

2 方法

2.1 模型制备 大鼠购回后于室温20 ℃，自然光照条件下适应性饲养1 周。采用博莱霉素气管内注入法复制大鼠肺纤维化模型。予地西泮（20 mg/kg）腹腔注射，再予盐酸氯氨酮（20 mg/kg）腹腔注射麻醉。待麻醉后将大鼠仰卧固定，消毒并切开颈部皮肤，逐层钝性分离软组织，暴露气管。在肉眼直视下，将已抽取博莱霉素溶液（8 mg ∶2 mL）的1 mL 注射器经两气管软骨间隙向心刺入气管并继续进针约0.75 cm，回抽无阻力后迅速注入0.3 mL 药液，随即将大鼠直立旋转，使药液在肺内均匀分布。缝合切口，局部皮肤作抗感染处理。正常组动物不造模，假手术组动物造模方法同造模组，仅用生理盐水替换博莱霉素进行气管内注入。

2.2 大鼠分组 随机分出正常组（27 只）、假手术组（27 只）和博莱霉素造模组（108 只）3 组，108 只大鼠造模成功后，按随机数字表随机分入4 个治疗组：模型组、生地注射组、生地口服组和甲强龙组，每组27 只。

2.3 药物干预 据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”折算[15]，以临床剂量换算大鼠用药剂量。生地注射组每日按10 mL/kg 体重腹腔注射生地提取物；生地口服组每日按1.5 mL/kg 体重腹腔注射生地提取物；甲强龙组每日按2 mg/kg 体重腹腔注射甲强龙，正常组和模型组每日予注射用水按10 mL/kg 体重灌胃。上述各组均造模后第1 天开始干预，直至处死日。

2.4 大鼠处理 各组分别于造模后第3 天、第7 天及第28 天各处死1/3 大鼠，即9 只大鼠。大鼠称重后予盐酸氯胺酮（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定，打开腹腔，予1 mL 肝素化针筒经腹主动脉穿刺采动脉血0.6 mL，即刻封闭针孔送血气分析检测。采血后立即延长切口打开胸腔，于近甲状软骨处切断气管，完整取出心肺。先将心脏和胸腺摘除干净取出完整肺脏组织，用0.9%生理盐水将取出的肺脏冲洗干净，放入无菌样品管中，置低温冰箱中保存待测。

2.5 动物肺组织匀浆的制取 先将组织标本从低温无菌样品管中取出，在微量天平上剪取组织样品约3 mg，在清洁的生物组织碾钵中先加入0.9%生理盐水1 mL，放入上述肺组织样品，反复加液氮，在液氮中迅速碾磨至组织完全粉碎，用移液器将碾钵中组织匀浆液移至清洁试管中，用0.9%生理盐水1 mL 冲洗碾钵共2 次，将冲洗液移至清洁试管中，低温离心2 000 r/min 共10 min，用移液器将上清液吸出移至清洁尖底管中，置低温冰箱待检。

2.6 观察指标 （1）动脉血气分析：第28 天进行血气分析检测，观察动脉氧分压（PaO2）、动脉氧饱和度（SaO2）、肺泡-动脉血氧分压差（PA-aO2）。（2）测定TNF-α 和IFN－γ 含量：肺组织匀浆总蛋白（TP）含量测定采用双缩脲法；肺组织匀浆TNF-α 和IFN-γ 含量测定均采用酶联免疫吸附法（ELISA）法，按照TNF-α 和IFN-γ 的ELISA 试剂盒使用说明书检测TNF-α 和IFN-γ 的含量。TNF-α 和IFN-γ 相对含量采用其与肺组织匀浆TP 的比值来表示。

2.7 统计学方法 实验数据经正态性检验后均以均数±标准差（s）表示。采用SPSS21.0 统计软件，组间多样本均数的比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，两组间比较经q 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肺组织标本大体观察 第3 天正常组肺脏呈均匀粉红色，质地柔软；余各组肺脏粉白相间，质地稍硬，部分肺脏组织表面有出血点。第7 天正常组肺脏呈均匀粉红色，质地柔软；余各组肺脏粉白相间，质地稍硬，部分肺脏组织表面出现片状出血。第28 天正常组和假手术组肺脏呈均匀粉红色，质地柔软；生地注射组和生地口服组粉白相间，肺脏表面稍见凹凸不平，但无结节，质偏硬；甲强龙注射组粉白相间，肺脏表面部分凹凸不平，有1 例肺脏表面有结节、质偏硬；模型组肺脏苍白，体积略小，肺脏表面凹凸不平，甚至有结节，质硬。该观察亦提示肺间质纤维化模型大鼠造模成功。

3.2 动脉血气分析 与假手术组相比，模型组PaO2减小（P＜0.01）；与模型组相比，生地注射组PaO2增大（P＜0.05），生地口服组和甲强龙组PaO2有增大趋势。与假手术组相比，模型组SaO2减小（P＜0.05）；各给药组SaO2较模型组有增大趋势。与假手术组相比，模型组PA-aO2增大（P＜0.01）；与模型组相比，生地注射组PA-aO2减小（P＜0.05），其余各给药组PA-aO2有减小趋势。正常组、假手术组两组之间各指标均无显著差异。见表1。

表1 第28 天各组大鼠动脉血气分析结果比较（

表1 第28 天各组大鼠动脉血气分析结果比较（

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

3.3 肺组织匀浆TNF-α 相对含量 第3 天、第7天、第28 天，与假手术组相比，模型组TNF-α 升高（P＜0.01）；正常组、假手术组两组之间均无显著差异。第3 天与模型组相比，生地注射组TNF-α 降低（P＜0.05），生地口服组和甲强龙组有降低趋势。第7天各组TNF-α 均升高，达到高峰；与模型组相比，生地注射组（P＜0.01）、生地口服组（P＜0.01）、甲强龙组（P＜0.05）均降低。第28 天各组TNF-α 均较低7天降低；与模型组相比，各给药组均降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肺组织TNF-α 相对含量（TNF-α/TP）比较

表2 各组大鼠肺组织TNF-α 相对含量（TNF-α/TP）比较

注：与假手术组相比，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

3.4 肺组织匀浆IFN-γ 相对含量 第3 天、第7 天、第28 天，与假手术组相比，模型组IFN-γ 降低（P＜0.01）；正常组、假手术组两组之间均无显著差异。第3天与模型组相比，生地口服组（P＜0.05）、甲强龙组（P＜0.01）IFN-γ 升高，生地注射组有升高趋势。第7 天各给药组IFN-γ 较模型组有升高趋势。第28 天与模型组相比，生地注射组和甲强龙组IFN-γ 升高（P＜0.05），生地口服组有升高趋势。见表3。

表3 各组大鼠肺组织匀浆IFN-γ 相对含量（IFN-γ/TP）比较

表3 各组大鼠肺组织匀浆IFN-γ 相对含量（IFN-γ/TP）比较

注：与假手术组相比，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

4 讨论

生地治疗肺纤维化的临床研究主要包括改善血气分析及肺功能指标、降低TGF-β1、降低TNF-α、调节体液免疫和血液流变学；基础研究主要包括改善肺系数及肺组织病理变化、抑制胶原表达、清除氧自由基、调节细胞因子、改善细胞外基质代谢等。

曙光医院肺病科在以往研究工作基础上，提出“气络伤”是肺纤维化病机核心的理论，“气络伤”即气络的损伤。从肺之气络探讨肺纤维化的病机有两方面[16]：其一为气络本身及功能失调；其二为邪犯气络，具体包括邪伤卫气、痰瘀伏络、阴伤肺热、他脏失调而内邪干肺络。据此，肺纤维化的治疗原则乃气络虚者宜通补、气络瘀者宜通、通络宜味辛、调补他脏通络。生地清热养阴生津、补肾通痹的作用为肺纤维化的治疗提供了新的方向。

在临床肺纤维化阶段，动脉血气分析通常显示轻度低氧血症，但活动时弥散量减少、PA-aO2加大，使PaO2进一步降低，而动脉血二氧化碳分压（PaCO2）即使在病程后期通常能维持在正常范围。患者低氧血症是由通气/血流比例失衡和弥散功能异常产生的；弥散功能异常是由于肺泡毛细血管的横截面积减少和红细胞通过具有功能的肺毛细血管床的单位时间过短以致不能使血红蛋白与氧充分饱和所致[17]。我们的前期研究[14]显示表明生地可抑制炎症反应，减少气道腺体分泌，促进肺泡气体交换，从而改善PaO2和SaO2。本研究表明生地注射组在第28 天可提高PaO2、减少PA-aO2（P＜0.05）；生地口服组在改善PaO22、SaO2及PA-aO2方面显示出优于模型组的趋势。提示生地提取物显示出一定的改善肺纤维化大鼠动脉血气分析指标的能力，且腹腔注射的给药方式疗效更加显著。

肺纤维化的基础是细胞因子网络调控失衡导致大量趋化因子释放从而引起炎性细胞聚集、活化[18]，其中TNF-α 是肺纤维化过程中起重要作用且具有广泛生物活性的细胞因子，由巨噬细胞分泌，可参与局部损伤和炎症反应。当肺组织损伤后，巨噬细胞募集到损伤组织周围并被激活，释放出TNF-α，一方面TNF-α 加重炎症反应，另一方面能促进纤维母细胞增生，分泌大量胶原[19]。现在普遍认为TNF-α 与IL-1起协同作用，激活中性粒细胞，介导了早期肺泡炎症反应。本研究表明第7 天和第28 天，生地注射组和生地口服组可降低TNF-α（P＜0.01-0.05），提示生地提取物可使肺纤维化模型大鼠肺组织TNF-α 含量降低。

IFN-γ 由Th1 淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌，具有强大的免疫调节作用，是一种抗纤维化的细胞因子，可拮抗Th2 细胞因子白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）等的促纤维化活性，也可拮抗TGF-β 促胶原合成作用，同时能抑制纤维母细胞合成胶原。在大鼠肺纤维化模型中，IFN-γ 可明显抑制纤维化的进展。曾有研究发现IFN-γ 加小剂量激素长期治疗对单用激素无效的特发性肺纤维化患者，可使高表达的TGF-β1b 下调，病情得到实质性改善，肺总量、氧分压均有明显增加[20]。本研究表明生地注射液（第28 天）、生地口服组（第3 天）能升高IFN-γ 含量（P＜0.05），生地注射组（第3 天、第7 天）、生地口服组（第7 天、第28 天）在升高IFN-γ 方面均显示出优于模型组的趋势，提示以生地提取物能使肺纤维化大鼠的肺组织IFN-γ 含量升高。

本研究结果表明生地提取物可改善肺纤维化大鼠动脉血气分析指标，从而有效治疗肺纤维化，其机制可能和抑制TNF-α 表达以及促进IFN-γ 分泌有关。