石斛的氨基酸组成及分析

陈玉芹 胡永亮 白燕冰 周侯光 李泽生

摘  要  利用全自动氨基酸分析仪测定22种主要石斛栽培品种的氨基酸组成和含量，并应用多元统计分析方法对其品质进行分析。结果表明，石斛中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸4种氨基酸含量最丰富;蛋氨酸和胱氨酸分别为石斛的第1和第2限制性氨基酸。不同品种石斛的氨基酸含量和组成比例存在一定差异，其中，10种石斛含有17种氨基酸和7种必需氨基酸，11种石斛未检出蛋氨酸或胱氨酸。参照FAO/WHO推荐标准，氨基酸营养价值较高的是线叶石斛、紫瓣石斛、杓唇石斛、玫瑰石斛、紫菀石斛和叠鞘石斛6个品种;采用主成分分析方法和聚类分析，可将22种石斛氨基酸分为4类品质，以石斛氨基酸指标聚类可将22种石斛聚为3类。

关键词  石斛属; 氨基酸; 色谱法; 主成分分析; 聚类分析中图分类号  S567     文献标识码  A

Amino Acids in Dendrobium SW.

CHEN Yuqin， HU Yongliang， BAI Yanbing， ZHOU Houguang， LI Zesheng^*

Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan 678600， China

Abstract  The composition and content of amino acids in 22 speciesDendrobiumwere determined by an automatic amino acid analyzer， and multivariate statistics analysis were performed to provide a reference for the quality. The most abundant amino acids were aspartic acid， glutamic acid， leucine and arginine; methionine and cystine were the first and second restricted amino acids inDendrobium. There was a significant difference in the content of amino acid and the composition. Ten in the 22 species ofDendrobiumcontained 17 amino acids and 7 essential amino acids. No methionine or cystine was detected in 11 species.D. aurantiacum， D. parishii， D. moschatum， D. crepidatum，D. transparens，D. aurantiacumvar. were classified as the richest in amino acids based on the recommendation of FAO/WHO. The amino acids could be divided into four groups by quality with principal component analysis and cluster analysis， andDendrobiumwere classified into three categories.

Keywords  DendrobiumSW.; amino acid; chromatography; principal component analysis; clustering analysis

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.022

石斛是蘭科（Orchidaceae）石斛属（Dendro biumSW.）植物，Dendrobium是由希腊文dendro（树）及bios（生命）组合而来，有附生于树上之意^[1]。全球约有1700种石斛，广泛分布于亚洲热带和亚热带地区及大洋洲。《中国植物志》收录我国石斛74种和2变种，其中云南产58种2变种，该属植物又细分为禾叶组、顶叶组、石斛组、心叶组、瘦轴组、叉唇组、距囊组、黑毛组、草叶组、基肿组、剑叶组、圆柱叶组等12组^[2];Flora of China（《中国植物志》英文修订版）订正及增加新种收录共为78种，分为14个组。石斛中含有丰富的营养物质和诸多特有的天然活性成分^[2-5]，具有润肺生津、活血化瘀、治疗心血管疾病等功效^[6]，已成为制药和保健品的重要原料。近年来，一些研究学者在对天然药物药理活性物质的探索研究中，发现氨基酸与药效存在着密切关系，刘振鹏、张爱莲等学者认为，铁皮石斛呈现味甘淡、微咸与氨基酸组成特性有关，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸是发挥临床与保健功效、调节口感的重要成分^[7-8]，对人体也有良好的保健作用。

石斛属植物中氨基酸水平不尽相同，含量也存在差异，而石斛氨基酸是石斛发挥药效、调节口感的重要物质基础。研究报道主要集中在铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛等几种常见种^[7-10]，但也仅限于针对一种石斛不同组织或至多仅几种石斛属植物间比较。本研究采用方差分析、主成分分析法和聚类分析法等对石斛属22种石斛的氨基酸含量进行分析，从不同角度对石斛进行研究，为石斛的开发提供新思路。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  植物材料  22种石斛采摘于云南省德宏热带农业科学研究所石斛种质资源圃，采摘其鲜条，55 ℃烘干至恒重，粉碎备用。样品详细信息见表1。

1.1.2  仪器  组织磨样器（济南泰和盈科商贸有限公司，型号RETSCH MM400）、电子分析天平（上海恒勤仪器设备有限公司，型号ME204）、台式冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司，型号TGL20MW），全自动氨基酸分析仪（大昌华嘉商业（中国）有限公司，型号Biochrom30+）。

1.1.3  试剂  17种氨基酸混标（胱氨酸摩尔浓度0.125 ?mol/mL，其余16种氨基酸摩尔浓度0.25 ?mol/mL） （大昌华嘉商业（中国）有限公司），浓盐酸（分析纯），异丙醇（分析纯），95%乙醇，茚三酮（大昌华嘉商业（中国）有限公司），高纯氮气（99.999%），不同pH缓冲液^[11]。

1.2方法

1.2.1  样品前处理  参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》，准确称取石斛粉末样品0.2 g（精确到0.0001 g）于10 mL安剖瓶中，制备水解液，转移至10 mL离心管，3500 r/min离心5 min，取1 mL上清液置于10 mL烧杯中，（60±5）℃水浴干燥，待液体快蒸干再加入1 mL去离子水，重复操作3次，蒸干。加入1 mL pH 2.2稀释液，混匀后过0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

1.2.2  氨基酸标准曲线制备  取200 μL混合氨基酸标准品，加入800 μL pH 2.2稀释液，充分混匀，进样10、20、30 μL上机测定17种氨基酸，根据各氨基酸的响应值与浓度绘制标准曲线。

1.2.3  检测条件  检测器：检测器1波长570 nm，检测器2波长440 nm，进样量20 μL，色谱柱为氨基酸分析的Na⁺专用柱。

1.3数据处理

数据经Excel软件整理后用SPSS 24.0软件进行One-way ANOVA检验，结果用平均值±标准差表示;采用多元统计分析方法中的因子分析主成分提取方法^[12-13]和系统聚类分析对石斛氨基酸进行分析。

2  结果与分析

2.1石斛中氨基酸含量与组成

由表2可以看出，不同品种石斛的氨基酸含量和组成存在一定差异，其中反瓣、剑叶等10种石斛均含有17种氨基酸和人体所需的7种必需氨基酸;翅萼、龙石斛等11种石斛含有16种氨基酸和人体所需6种必需氨基酸，蛋氨酸未检出;玫瑰石斛未檢出胱氨酸。通过对22种石斛的17种氨基酸指标进行描述性统计分析发现（表3），石斛中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸4种氨基酸含量最丰富;蛋氨酸和胱氨酸含量最低，分别为石斛的第一和第二限制性氨基酸。由变异系数可看出，22种石斛中的氨基酸含量差异较大，呈中变异到高变异，其中蛋氨酸、精氨酸、天冬氨酸3种氨基酸差异最大，分别为118.37%、108.10%、51.65%。

22种石斛中总氨基酸（TAA）、必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）含量有很大差异。TAA含量：50 mg/g以上的石斛有3种; 40～50 mg/g有1种;30～40 mg/g有4种;30 mg/g以下有14种。EAA含量：10 mg/g以上有12种，10 mg/g以下有10种;NEAA含量在（9.16±1.27）～（43.25± 1.17）mg/g，其中，苏瓣石斛最高，杓唇石斛最低。22种石斛中EAA/TAA比值差异不大，主要集中在35%～40%之间，NEAA/TAA比值主要集中在50%～70%之间。植物蛋白质的营养价值主要取决于其必需氨基酸的组成和比例，据FAO/WHO推荐，质量较好的蛋白质EAA/NEAA在60%以上，EAA/TAA为40%左右。线叶石斛、紫瓣石斛等6种石斛蛋白质营养价值更合理，能提高人体对蛋白质的吸收利用率，可作为优质蛋白源。

2.2主成分分析

2.2.1  氨基酸指标间相关性检验、KMO和Bartlett球形度检验  从相关系数矩阵（表4）可以看出，除了胱氨酸与其余16种氨基酸没有相关性，其他氨基酸均呈现极显著相关，说明大部分信息重叠。经KMO和Bartlett球形度检验，KMO值为0.803，呈强相关性，Bartlett球形度检验的相伴概率P<0.05（显著水平）进一步说明本研究中石斛各氨基酸指标间存在相关性。因此，本研究采用因子分析主成分提取方法有效。

2.3聚类分析

以17种氨基酸和总氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸为变量进行聚类分析（图2），可以将22中石斛分为3大类，密花石斛、叠鞘石斛、紫瓣石斛等18种石斛聚为一大类;钩状石斛、紫菀石斛、金耳石斛3种石斛聚为一类，苏瓣石斛单独为一类。以22种石斛综合得分为变量进行聚类分析（图3），由图3可看出，可将22种石斛聚类为四类品质，苏瓣石斛单独聚为一类品质，钩状石斛、紫菀石斛、金耳石斛3种石斛聚为第二类品质，龙石斛、杓唇石斛、密花石斛等8种石斛聚为第三类品质，反瓣石斛、豆苗石斛、永福石斛等10种石斛聚为第四类品质。

3  讨论

本文首次针对22种不同石斛的氨基酸组成进行测定分析，结果表明不同品种石斛的氨基酸含量和组成比例存在一定差异。22种石斛中10种石斛含有17种氨基酸和7种必需氨基酸，11种石斛未检测出蛋氨酸或胱氨酸，这可能是因为石斛蛋氨酸或胱氨酸的含量很低，经酸水解被严重破坏而未能检出。通过分析可发现石斛中主要以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸4种氨基酸含量最丰富;蛋氨酸和胱氨酸含量最低，分别为石斛的第一和第二限制性氨基酸。这与栾洁^[14]、汪群红^[15]、魏静^[16]研究铁皮石斛氨基酸的含量结果相似，但与徐兰芳^[17]研究铁皮石斛氨基酸的结果不一致。徐兰芳^[17]试验样品为不同附生树上的铁皮石斛，得出不同活树附主对铁皮石斛上的氨基酸含量有影响，含量差异显著。本研究的石斛样品均为大棚基质栽培，这也说明栽培模式对石斛氨基酸的形成具有影响。徐德利等^[18]研究表明石斛的氨基酸含量受其基因型的影响极大，张爱莲^[8]研究表明铁皮石斛中氨基酸含量很大程度上受药材品种的影响，通过品种选育有望提高铁皮石斛药材中的氨基酸。本研究的供试样品采自同一产地，栽培环境和基地管理均一致，但采摘样品生长年限不同，含量差异较大是否受基因型影响较大，需进一步开展石斛生长中氨基酸的积累规律研究，探讨影响石斛氨基酸的主要因素。

通过采用多元统计分析方法中的主成分分析和聚类分析，22种石斛中氨基酸存在显著相关性，提取2个主成分并分别解释了83.347%、7.159%的方差，累积贡献率达到90.506%，这表明2个主成分集中了原始氨基酸17个变量信息的90.506%。根据主成分线性表达式和石斛氨基酸品质综合评价模型，得出石斛氨基酸品质排名。根据FAO/

WHO推荐的标准，线叶石斛、紫瓣石斛、杓唇石斛、玫瑰石斛、紫菀石斛、叠鞘石斛6种石斛可作为优质蛋白源。2种方式评价石斛氨基酸的结果不一致，这可能是分析方法的侧重点不同，主成分分析更侧重于每种氨基酸信息量的权重，而FAO/WHO推荐是根据人体所需的氨基酸比例来分析，这就说明不同的分析方法和衡量指标获得不同的结果，需要根据目的来具体选择分析方法。另外，以氨基酸为变量聚类可将22中石斛分为3大类，以石斛氨基酸品质综合得分为变量聚类可将22种石斛聚类为4类品质。这就说明以不同的指标作为变量也会聚类出不同的结果，刘威等^[19]的研究结果有相似的看法，因此，可以多角度、多方位分析研究石斛，为石斛的开发提供更加全面的新思。

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