金刚烷胺单克隆抗体的制备和鉴定

范素菊 李嘉 李森 杨兴东

摘要：为制备金刚烷胺（AMD）的单克隆抗体（mAb），改造AMD的半抗原，采用EDC/NHS法合成人工免疫原AMD-BSA和检测抗原AMD-OVA，经紫外扫描和凝胶电泳进行鉴定，AMD与载体蛋白[牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵白蛋白（OVA）]成功偶联;用被免疫原（AMD-BSA）免疫BALBC/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，获得AMD杂交瘤细胞株，腹腔注射小鼠后，得到抗AMD的mAb。小鼠免疫后的多抗血清的效价均在6.4×103以上，所制得的杂交瘤细胞上清液的效价为3.6×102～1.0×103，2D5细胞株的腹水效价为5.12×105，对AMD的IC50值为1.02 μg/L，除与金刚乙胺的交叉反应率为9.82%，与其他结构类似物无交叉反应性。表明获得了高价、敏感和特异的抗AMD的单克隆抗体，为进一步的免疫学快速检测提供了技术支持。

关键词：金刚烷胺;免疫原;单克隆抗体;ELISA;抗体制备;抗体鉴定

中图分类号： S852.4+3

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）15-0220-04

金刚烷胺（amantadine，AMD）是一种稳定、无色、结晶的胺，具有特殊的对称性结构。由于其具有干扰M2流感病毒蛋白合成和抗胆碱的作用[1]，临床上用作抗帕金森病毒和抗病毒药物[2-3];在动物饲养中，AMD主要用于治疗和预防禽流感和猪的传染性胃肠炎[4-5]。但是，AMD的过度使用会对人类和环境产生不利的生态后果。首先，它的广泛使用可以增加细菌耐药菌株的发生[6-8]。其次，AMD的残留物可能通过食物链进入人体。AMD在人体内蓄积6周以上可以引起恶心、头晕、失眠、心慌等影响[9]。事实上，美国食品和药物管理局已经禁止在牲畜中使用AMD;2005年，中国原农业部（公告号：560）禁止AMD作为家禽的抗病毒兽药。然而，由于其低廉的价格和可用性，家禽业中AMD仍然作为A型禽流感的治疗药在非法使用[6]。因此，已经建立了许多分析方法以检测AMD的残留。

代谢研究结果表明，AMD在体内以原型形式存在并在体内积聚[10]。目前，AMD检测方法包括液相色谱法[11-12]、荧光液相色谱法[13]、高效液相色谱法[14-15]、毛细管区带电泳法[16]、选择性和荧光分光光度法[17]、气相色谱法[18]、毛细管气体色谱法[19]、五氟苯甲酰氯萃取衍生化气相色谱法[20]和液相色谱-串联质谱法[21]。虽然这些方法准确而敏感，但这些色谱方法需要昂贵的设备、繁杂的预处理、技术熟练的操作人员，因此，它们不适合AMD的现场筛查。可见，在动物源性食品中开发直观、灵敏、高效的AMD检测分析方法至关重要。酶联免疫吸附测定（ELISA）[22]和胶体金免疫层析测定[23]代表快速、特异、方便和高度敏感的方法，适用于分析大量样品。在这项研究中，制备了一种针对AMD的新型单克隆抗体，为今后的免疫学快速检测提供技术上的支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金刚烷胺、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、羟琥珀亚酰胺（NHS）、弗氏佐剂，Sigma公司产品;羊抗鼠酶标二抗，洛阳华美生物工程有限公司;其他试剂均为AR级。SPF级雌性BABLC/c小鼠购自郑州大学实验动物中心，由周口师范学院神经转化医学实验动物中心饲养。

仪器设备：Thermo Scientific NanoDrop 2000c紫外分光光度计，Thermo Electron;Multiskan FC型酶标仪，上海赛默飞世尔仪器有限公司;LHS-450恒温培养箱，郑州生元仪器有限公司;AR224CN电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司;凝胶成像系统及分析软件，上海天能科技股份有限公司;DYY-6D型电泳仪电源，北京六一生物科技有限公司;90-2定时恒温双向磁力搅拌器，上海精科实业有限公司;HCJ-4A数显恒温磁力搅拌水浴锅，常州市金坛区指前镇旭日实验仪器厂;SW-CJ-2G型超净工作台，苏州净华仪器有限公司;3701型二氧化碳培养箱，USA Precision公司。

1.2 方法

1.2.1 AMD免疫原的合成及鉴定 参考Xu等报道的方法进行AMD免疫原的合成[22]。80 mg AMD充分溶解在 3 mL 的甲苯和一定量的二碳酸二叔丁酯溶液中，然后加入105 mg 6-溴乙酸乙酯，在氮气保护下升温至128 ℃充分回流2 d，旋转蒸发后的产物调节pH值至10，然后调节pH值为1，干燥浓缩后得含有羧基的AMD半抗原（图1-A）。取 12 mg AMD半抗原，加入3 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，依次加入11 mg NHS，17 mg EDC，冰浴条件下搅拌反应18 h，得到A液;30 mg牛血清白蛋白（BSA）加入3 mL PBS溶液中（B液）。将A液慢速滴加到B液中，室温下反应1 d;放入透析袋中用PBS缓冲液透析3 d，制得AMD免疫原，其反应路线见图1-B。利用紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[24]来判断AMD和载体蛋白是否成功偶联。

1.2.2 动物免疫 用70 mg免疫原（AMD-BSA）和等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射到3只小鼠，间隔18 d之后用同样的剂量与弗氏不完全佐剂乳化后，对BABLC/c小鼠进行免疫，先后共免疫5次;免疫结束后，小鼠尾静脉采血，得到抗AMD多克隆抗体血清（polyclonal antibody serum，pAbs），并进行鉴定。

1.2.3 单克隆抗体制备 利用融合剂PEG4000，将免疫最优小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0按一定比例混合，并加入GNK溶液和HAT培养基，然后将混合液按0.1 m/孔加入到铺有饲养细胞的细胞培养板中，用酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性孔，有限稀释法对筛选到的阳性孔进行亚克隆，得到抗AMD的杂交瘤细胞株，将细胞株注入到经液体石蜡处理过的小鼠腹腔中，以此来制備抗AMD mAbs。

1.2.4 AMD mAbs的鑒定

1.2.4.1 抗AMD mAbs效价测定 间接ELISA检测抗AMD mAbs效价[25]：检测抗原（AMD-OVA）包被在ELISA板内;依次加入倍比稀释的AMD mAbs、酶标二抗和显色液，每步孵育一定时间后均用PBST洗板;加入终止液后，放入酶标仪进行测定。

1.2.4.2 抗AMD mAbs敏感性测定 间接竞争ELISA检测mAbs对AMD的半数抑制浓度（IC50），以此来鉴定其敏感性。其操作过程与间接ELISA的区别在于包板后，每孔加入D450 nm值为1.0左右的mAbs和倍比稀释的AMD标准品。

1.2.4.3 AMD mAbs特异性测定 依据交叉反应（cross reaction，CR）试验鉴定AMD的特异性。用间接竞争ELISA测定金刚乙胺、金刚烷、1-金刚烷羧酸、利巴韦林、吗啉胍、阿昔洛韦、呋喃唑酮等类似物的IC50值。CR=（金刚烷胺IC50值/其他化合物IC50值）×100%。

2 结果与分析

2.1 AMD免疫原的鉴定结果

图2显示，BSA的吸收峰（10 mm）在280 nm的位置，AMD的吸收峰在412 nm的位置，AMD-BSA的吸收峰（10 mm）与BSA的吸收峰相比发生了向右偏移，表明半抗原AMD与BSA已经联结。BSA的泳动速率略大于AMD-BSA的泳动速率（图3），分析物分子质量的大小与泳动速率成反比，由此可知BSA与AMD成功联结。

2.2 AMD pAbs的效价、敏感性鉴定结果

免疫原（AMD-BSA）免疫的1号和2号BABLC/c小鼠的pAbs效价都达到6.4×103以上，2号小鼠达到1.28×104（图4），表明AMD pAbs效价较高，免疫原（AMD-BSA）的免疫原性优良。3只被免小鼠的mAbs均有抑制的产生，其中以3号被免小鼠的抑制最优（图5），以AMD的稀释浓度的对数值为横坐标，标准品测定值/不加标准品测定值（B/B0）为纵坐标作图，线性回归方程：y=-0.406 1x+1.008 6，r2=0991 6，由此方程推算出AMD的IC50值为17.88 μg/L，进一步表明mAbs具有较高的敏感性。

2.2 AMD mAbs的鉴定结果

2.2.1 效价测定结果 利用ELISA筛选出4株杂交瘤细胞稳定分泌的AMD mAbs，其效价较高，其中2D5细胞株的上清液效价最优，用此株诱生抗AMD的腹水，效价为2.15×105（表1）。

2.2.2 敏感性界定结果 间接竞争LEISA测定细胞株的AMD mAbs的回归方程为y=-0.311 6x+0.502 4（r2=0.990 3）（图6），2D5对AMD的IC50为1.02 μg/L，进一步表明本研究所制得的mAbs对AMD的敏感性较好。

2.2.3 AMD mAbs的特异性鉴定结果 AMD mAbs与金刚乙胺的CR为9.82%，与金刚烷、1-金刚烷羧酸、利巴韦林、吗啉胍、阿昔洛韦、呋喃唑酮等类似物没有CR（表2），进一步表明AMD mAbs特异性较强。

3 讨论与结论

高质量的抗原是制备优质抗体的基础。根据文献报道，Xu等首先利用二碳酸二叔丁酯保护AMD上的氨基，然后使用6-溴乙酸乙酯在AMD上引入活性基团[—（CH2）5COOH]， 运用EDC/NHS法与载体蛋白（BSA或OVA）进行连接，免疫小鼠后的AMD mAbs IC50值为 50 μg/L[22];Wu等采用EDC和乙二胺改造载体蛋白（BSA或OVA）的羧基位点使之转换为氨基，然后利用戊二醛法使AMD与载体蛋白发生偶联;制备所得多抗具备一定效价，免疫小鼠后，获得的AMD mAbs具有较高的效价（1×104以上），但对AMD的抑制率偏低（10%以下）[23]。

虽然紫外扫描、色谱法、SDS-PAGE等通常被用来鉴定免疫原的制备结果，但是紫外扫描由于半抗原和载体蛋白及偶联物的溶解基质不同，同时不用的浓度产生的波峰不尽相同，所以判定起来存在困难;色谱法存在操作繁杂、耗时长和须要不断地熟悉操作等缺点，现实应用起来较为吃力;AMD的分子质量较小（<200），与载体蛋白的偶联数目有限[1 ∶ （10～25）]，使得通过SDS-PAGE来判定是否成功联结判定结果很难用肉眼区分开来。小鼠血清的IC50鉴定是判断成功偶联最可靠的手段，但是等待时间较长，一旦失败，须从头再来，使得试验周期大大增加。综上所述，寻找切实可行的免疫原的鉴定方法是广大免疫工作者须解决的问题。

本研究小鼠的效价均在6.4×103以上，利用细胞融合技术筛选出4株特异性、特异性较强的细胞株，制备出AMD mAbs，并对其效价、敏感性及特异性进行了鉴定，mAbs对AMD的IC50为1.02 μg/L，结果表明，以该抗体为基础，能够为以后AMD残留的免疫检测方法的建立提供技术支持。

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