藏药三味宽筋藤汤散质量标准研究

1.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；2.阿坝州藏医医院，四川 马尔康 513229

三味宽筋藤汤散，藏文音译是“勒哲松汤”，原方载于《四部医典》，由宽筋藤、渣驯膏、诃子肉三味藏药组成[1]，剂型为汤散剂，具有祛风除痹、消肿止痛、干黄水的作用。用于关节急慢性红肿、胀痛、伸屈不利、四肢僵硬，痛风、痹证。作为经典藏药处方，在阿坝州藏医医院临床上主要应用于类风湿性关节炎、痛风等，效果佳，但通过查询尚无其质量控制的相关文献报道。诃子为 《中国药典》收载的传统药物品种，尤其在民族医学藏药和蒙药中最为常用[2]，为本处方的主要药味之一，其有效成分没食子酸的含量较高。没食子酸具有解痉、抗氧化、抗菌及强心等药理作用[3]，与三味宽筋藤汤散的临床药效密切相关。本文初步建立藏药三味宽筋藤汤散的质控项目，采用显微鉴别法、薄层色谱法、理化鉴别法定性鉴别藏药三味宽筋藤汤散中的宽筋藤、诃子2味药材，高效液相色谱法测定没食子酸相对含量，这对建立藏药的质量标准有着重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)；BX35生物显微镜II (奥林巴斯医疗株式会社)；JPCT0328全数字超声波发生器(武汉嘉鹏电子有限公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；AUW120D电子天平(SHIMADZU)；JA203H型电子天平(常州市幸运电子设备有限公司)；HH-S8数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)。

1.2 材料 没食子酸对照品(批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院)；诃子对照药材(批号：121015-201605，中国食品药品检定研究院)；宽筋藤、诃子肉、渣驯药材，经阿坝州藏医医院泽戈主任藏医药师鉴定为正品，均由阿坝州藏医医院制剂中心提供；三味宽筋藤汤散(批号：20190211，阿坝州藏医医院配制)；甲醇为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 宽筋藤为茎类药材，渣驯膏为岩石中富含腐殖质的古生物化石在地质作用下渗出后，与复齿鼯鼠或红耳鼠兔粪粒的混合物[4]，诃子肉为果实类药材，三者显微特征差别较大，具有互不干扰的专属性特征，并易于观察。将三味宽筋藤汤散制片后(染色片、水合氯醛透化片、水装片等)，置于显微镜下观察。

2.1.1 宽筋藤 将三味宽筋藤汤散制片后在显微镜下观察，可见韧皮纤维成束，周围薄壁细胞含方晶成晶鞘纤维，为宽筋藤的显微特征[5]。

2.1.2 诃子肉 将三味宽筋藤汤散制片后在显微镜下观察，可见多数石细胞，呈类方形、类多角型或不规则形，有的一端稍膨大，细胞壁上纹孔密集，为诃子的显微特征[6]。

2.2 理化鉴别[7]宽筋藤中主要成分为生物碱[8]，参考药品标准，对其生物碱进行理化鉴别。取宽筋藤药材、三味宽筋藤汤散、三味宽筋藤汤散(缺宽筋藤)三种粉末各5 g，分别加入酸性乙醇30 mL，回流30 min，滤过，取滤液15 mL，用5%氢氧化钠溶液调至中性，水浴上蒸干，加入6 mL5%硫酸溶液溶解，滤过，取滤液3 mL分置A、B、C三支小试管中，每支试管1 mL，依次加入碘化铋钾试液、碘化汞钾试液、硅钨酸试液1～2滴，结果见表1。

表1 理化鉴别结果

2.3 薄层鉴别 参考文献[9]和2015 年版《中国药典》四部通则0502 薄层色谱法[10]，精密称取三味宽筋藤汤散2 g，诃子对照药材0.5 g，三味宽筋藤汤散(缺诃子肉)2 g，分别加入5 mL乙醇溶液，超声处理(功率250W，频率40kHZ)0.5 h，放冷，取上清液滤过，取续滤液，待用。吸取上述三种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，日光下检视。三味宽筋藤汤散与诃子对照药材在色谱相应的位置，显相同颜色的斑点，三味宽筋藤汤散(缺诃子肉)无干扰。如图1所示。

2.4 HPLC法测定没食子酸的含量

2.4.1 色谱条件[11-12]色谱柱：Inertsil ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：40℃；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液(2∶98)；流速1.0 mL/min；检测波长273 nm；进样量10 μL，理论塔板数按没食子酸计算应不低于2000。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品10.65 mg，置25 mL棕色量瓶中，加入50 %甲醇溶解并定容，即得0.426 mg/mL溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 精密称取三味宽筋藤汤散(20190211)0.4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减少的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4.4 阴性样品溶液 按处方(除诃子肉药材外)与制法，制成阴性样品溶液。其余处理同供试品溶液。

2.4.5 测定法 分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。如图2所示。

2.4.6 线性关系考察 精密吸取“2.4.2”项下没食子酸对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，得到对照品溶液浓度分别为：0.004 26、0.021 3、0.042 6、0.106 5、0.213、0.426 mg/mL溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别进样10 μL测定峰面积，以色谱峰面积为纵坐标(y)，对照品溶液浓度为横坐标(x)进行回归，得回归方程为y=29193x+ 141618(R2=0.9993)，在0.004 26～0.426 mg/mL范围内线性关系良好。

2.4.7 精密度试验 精密吸取“2.4.2”项下没食子酸对照品溶液0.5 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，精密吸取10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，测得其平均峰面积值为717643，RSD为1.88%。表明仪器精密度良好。

2.4.8 稳定性试验 取“2.4.3”项下供试品溶液10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测得峰面积RSD为1.42%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.9 重复性试验 取同一批号(20190211)样品6份，按2.4.3方法制备，按“2.4.1”项下色谱条件测定，结果没食子酸平均相对含量为5.37 mg/g，RSD为0.88%，表明此方法重复性良好。

2.4.10 加样回收率试验 取三味宽筋藤汤散(20190211)6份，每份约0.2 g，精密称定，1、2号样品加入含有量50%没食子酸对照品，3、4 号样品加入含有量 100%没食子酸对照品，5、6 号样品加入含有量 150%没食子酸对照品，按“2.4.3”项下方法制备，按“2.4.1”项下色谱条件，各取10 μL进样检测，结果见表2。

表2 没食子酸加样回收率结果 (n=6)

2.4.11 耐用性 取三味宽筋藤汤散(20190211)，按“2.4.3”项下方法制备，分别在色谱条件小的变动条件下：柱温(40.0±5)℃，流速(1.0±0.2)mL/min，波长(273±2)nm，测定没食子酸相对含量的RSD为1.62%，结果表明，此高效液相色谱条件测定没食子酸对照品时，柱温、流速、波长的变动小时耐用性强，满足系统适应性要求，本方法准确可靠。

3 讨论

3.1 理化鉴别 宽筋藤药材标准鉴别项下中有加新配重氮化试剂，显红色，由于三味宽筋藤汤散含渣驯膏，其在提取过程中溶液显酒红色，这个颜色反应不明显，故选择碘化铋钾试液、碘化汞钾试液、硅钨酸试液作为三味宽筋藤汤散的理化鉴别的显色试剂，沉淀明显。

3.2 薄层鉴别 预实验按照《中国药典》2015年版诃子项下对诃子药材进行定性分析，样品处理方法过于复杂，且重复性较差；样品处理方法直接选择超声处理(功率250W，频率40kHZ)0.5 h，放冷，取上清液滤过，取续滤液，待用；展开剂调整为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶10∶1)，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热显色，日光下检视，对照药材主斑点显色明显，供试样品相应位置斑点分离较好且阴性供试品无干扰。

3.3 色谱条件的选择 根据参考文献[11-12]，选择流动相：乙腈-0.05%甲酸水溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液，结果表明甲醇-0.2%磷酸对三味宽筋藤中没食子酸的分离效果较好。经反复实验，最终确定流动相为甲醇-0.2%磷酸(2∶98)，既能确保柱效的稳定性，又可达到较好的分离效果。