GC法测定维E三油胶丸中α-亚麻酸和γ-亚麻酸的含量

1.贵州省食品药品检验所,贵州 贵阳 550004；2.贵阳市食品药品检验检测中心，贵州 贵阳 550004

维E三油胶丸是贵州神奇药业有限公司独家生产的品种，曾用名为心脑三效胶丸，处方由维生素E、精鱼油、月见草油和苏子油组成，主要用于高脂血症。维E三油胶丸现行质量标准只对处方中的维生素E进行了质量控制，而未对处方中其他三种成分进行质量控制。为确保药品质量，保障用药安全，研究对处方中的精鱼油、月见草油和苏子油均进行了相应的质量控制。苏子油的主要有效成分为α-亚麻酸，具有降脂、降压、降糖、抑制出血性脑疾病和血栓性疾病、增强智力、增强免疫力、保护视力、预防过敏性疾病、预防炎症以及减缓人体衰老等功能[1-5]。月见草油的主要有效成分为γ-亚麻酸，具有抗炎、抗脂质氧化、抗血栓、降脂、降糖等作用,已应用于多种临床疾病[6-10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津GC-2014气相色谱仪(FID检测器)；岛津GC-2010plus气相色谱仪(FID检测器)；METTLER TOLEDO XS205电子天平；METTLER TOLEDO XPE206DR电子天平；PEG-20M(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛细管柱；DB-WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛细管柱；PEG-20M(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱。

1.2 试剂与试药 α-亚麻酸甲酯对照品(批号：111624-201705)、γ-亚麻酸甲酯对照品(批号：110898-201605)均购自中国食品药品检定研究院，二十一烷酸甲酯(批号：M2260010，ANPLE Laboratory Technologies(shanghai)Inc)；正二十四烷(批号：122365，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；十七烷酸甲酯(批号：T2370005，ANPLE Laboratory Technologies(shanghai)Inc)；正十九烷(批号：115410，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；其余试剂为分析纯，市售；维E三油胶丸(批号：S20171001、S20171002、S20171003、S20171004、S20171005、S20171006、S20171007、S20171008、S20171009、S20171010)均由贵州神奇制药有限公司提供。方法学实验样品批号为S20171010。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及测定法

2.1.1 色谱条件 采用DB-WΑX(30m×0.32 mm×0.25 μm)毛细管柱；柱温210℃；FID检测器；进样口温度和检测器温度为250℃；进样量1 μL；分流比为10∶1。二十一烷酸甲酯峰、α-亚麻酸甲酯峰和γ-亚麻酸甲酯峰分别与相邻峰之间的分离度均应符合要求。

2.1.2 测定法 精密称取二十一烷酸甲酯适量，加正庚烷配制成每1 mL约含2.5 mg 的溶液，作为内标溶液；精密称取α-亚麻酸甲酯和γ-亚麻酸甲酯对照品适量，加正庚烷配制成每1 mL约含α-亚麻酸甲酯15 mg 和γ-亚麻酸甲酯2.5 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液(1)，精密量取对照品溶液(1)和内标溶液各2 mL置10 mL量瓶中，加正庚烷定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取装量差异项下的内容物约0.2 g，精密称定，置具塞试管中，加入0.5 mol·L-1氢氧化钾甲醇溶液2 mL，密塞，置60℃水浴中皂化15 min，待油珠完全溶解，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，振摇，密塞，置60℃水浴中酯化2 min，放冷，精密加入正庚烷8 mL，振摇，加饱和氯化钠溶液2 mL，振摇，精密加入内标溶液2 mL，振摇，静置，取上层液作为供试品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1∶l，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。按内标法以峰面积分别计算供试品中α-亚麻酸和γ-亚麻酸的含量，结果乘以0.952，即得。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液的制备 精密称取二十一烷酸甲酯0.256 4 g置100 mL量瓶中，加正庚烷溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取α-亚麻酸甲酯对照品0.308 0 g和γ-亚麻酸甲酯对照品0.049 76 g置同一20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 专属性试验 采用厂家提供的缺月见草油阴性样品和缺苏子油阴性样品，按“2.1”条项下色谱条件及样品测定法进行检测，结果阴性样品均无干扰。供试品中α-亚麻酸甲酯峰、γ-亚麻酸甲酯峰和二十一烷酸甲酯峰的保留时间，与对照溶液中的保留时间一致，各测定峰峰型良好，与相邻峰分离度达到要求。

2.4 线性考察 精密量取对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0和5 mL分别置10 mL量瓶中，精密加内标溶液2 mL，加正庚烷定容至刻度，作为线性1到6溶液。分别吸取上述线性1到6溶液各 1(l注入气相色谱仪中，按“2.1”条项下色谱条件测定峰面积，记录色谱图。以α-亚麻酸甲酯和γ-亚麻酸甲酯对照品的浓度(mg/mL)为横坐标，α-亚麻酸甲酯和γ-亚麻酸甲酯峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。得α-亚麻酸甲酯回归方程：Y=1.837 6X-0.000 6(r=1.000)，表明α-亚麻酸甲酯在0.308 0～7.699 mg/mL范围内呈良好的线性关系；γ-亚麻酸甲酯回归方程：Y=1.824 8X+0.001 7(r=1.000)，表明γ-亚麻酸甲酯在0.049 71～1.243 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验 按“2.1”条项下制备供试品溶液和对照品溶液，室温下分别在0、2、4、6、8和12 h精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1(l注入气相色谱仪中，按“2.1”条项下的色谱条件测定峰面积，记录色谱图。结果对照品溶液和供试品溶液中α-亚麻酸甲酯与内标比值RSD分别为0.65%和0.90%，γ-亚麻酸甲酯与内标比值RSD分别为0.34%和0.28%。表明对照品溶液和供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 按“2.1”条项下平行制备6份供试品溶液，同时制备对照品溶液，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1∶l注入气相色谱仪中，按“2.1”条项下的色谱条件测定峰面积，记录色谱图，按内标法计算含量。结果α-亚麻酸含量为140.933 6 mg/g，RSD为0.68%；γ-亚麻酸含量为23.571 7 mg/g，RSD为0.73%。

2.7 回收率试验 精密称取γ-亚麻酸甲酯对照品0.050 11 g，置20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(1)；精密称取α-亚麻酸甲酯对照品0.290 7 g，置20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(2)。精密称取二十一烷酸甲酯0.063 00 g置25 mL量瓶中，加正庚烷溶解稀释至刻度，摇匀，即得内标溶液。精密称取样品约0.08 g、0.10 g和0.12 g，置50 mL具塞试管中，按“2.1”条下测定法同法操作至置60℃水浴中酯化2 min，放冷，各精密加入对照品贮备液(1)和对照品贮备液(2)0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL，再分别精密加入正庚烷6.4 mL、6.0 mL和5.6 mL，振摇，加饱和氯化钠溶液2 mL，振摇，精密加入内标溶液2 mL，振摇，静置，取上层液，即得。高、中、低3个浓度样品，各平行制备3份，共9份。结果α -亚麻酸回收率为99.44%(n=9，RSD=1.9%)，γ-亚麻酸回收率为99.14%(n=9，RSD=2.0%)。

2.8 耐用性试验 按“2.1”条项下测定法制备供试品溶液和对照品溶液，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1 μL注入气相色谱仪中，按“2.1”条项下的色谱条件测定峰面积，记录色谱图，按内标法计算含量。比较了不同色谱柱、不同进样口温度、不同检测器温度、不同柱温和不同仪器对测定结果的影响，各条件下，各色谱峰峰型良好，与相邻峰分离度均达到要求。结果表明该方法耐用性试验结果良好。

2.9 检出限和定量限的测定 按 “2.1”项下制备对照品溶液，并稀释制成不同浓度的对照品溶液，精密量取各1∶1注入气相色谱仪中，按“2.1”项条项下的色谱条件测定峰面积，记录色谱图，以信噪比S/N≈10时的质量浓度为定量限、S/N≈3时的质量浓度为检测限。测得α-亚麻酸和γ-亚麻酸的检出限约为29.3 ng和23.66 ng；测得α-亚麻酸和γ-亚麻酸的定量限约为146.6 ng和70.99 ng。

2.10 样品含量测定 按“2.1”条项下测定法制备10批次样品的供试品溶液，同时制备对照品溶液，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各1∶1注入气相色谱仪中，按“2.1”条项下的色谱条件测定峰面积，记录色谱图，按内标法计算含量，结果如下。

表1 10批次样品测定结果

3 讨论

3.1 样品制备过程的优选 经查阅相关文献资料及检验标准，要测定样品中α-亚麻酸和γ-亚麻酸的含量，需要对样品进行甲酯化后进行测定。目前甲酯化的方法主要有三氟化硼-甲醇法、酸催化法、快速甲酯化法等[6-7]。通过前期的大量实验，选择三氟化硼-甲醇法，该法由于其先用碱中和了非中性的游离脂肪酸，又用三氟化硼作酸性催化剂，在一定的温度下，加速了甲醇和油脂之间进行的醇解反应，使油脂的甲酯化既快又完全试验中加入饱和氯化钠可加大溶液中离子的强度，有利于脂肪酸甲酯被充分提取出[11-12]。影响提取α-亚麻酸甲酯和γ-亚麻酸甲酯的主要因素有溶剂、皂化及甲酯化试剂加入量、是否充氮保护等。同时，内标物也是在样品制备过程中加入，因此同时考察加入不同内标物对测定结果的影响。选取U4(44)表，考察因素及水平见表2，按表3进行实验，以 α-亚麻酸含量(Y1)，γ-亚麻酸含量(Y2)，α-亚麻酸甲酯峰峰型和分离度(Y3)，γ-亚麻酸甲酯峰峰型和分离度(Y4)，内标物峰型及分离度(Y5)为评价指标。

表2 考察因素及水平

表3 实验设计方案 (U4(44))

按“2.1”条下同法采用不同溶剂制备内标溶液和对照品溶液，依据表3按“2.1”条下同法制备供试品溶液。按“2.1”条下色谱条件，测定各号实验结果，见表4。

表4 均匀实验结果

表5 样品最佳制备条件验证试验结果

验证试验结果表明，所得最佳样品制备工艺结果较满意，重现性良好且易于操作，反映了本研究的设计方法和技术路线是科学、合理、必要和可行的。

3.2 限度范围 月见草油的现行标准为WS-10001-(-HD-0598)-2002，规定含γ-亚麻酸不得少于7.5%(g/g)。苏子油目前无药品标准，查询到中华人民共和国粮食行业标准LS/T3254-2017含α-亚麻酸为56.0%～70.0%。根据维E三油胶丸的处方，500g维E三油胶丸内容物含月见草油125 g，含苏子油125 g，折算维E三油胶丸中含α-亚麻酸与γ-亚麻酸应不少于140.0 mg/g和18.75 mg/g，考虑制剂制备过程的损耗及样品有效期，拟定维E三油胶丸中含α-亚麻酸与γ-亚麻酸应不少于126.0 mg/g和17.0 mg/g。从10批样品的测定结果可以看出，10批次样品含α-亚麻酸和γ-亚麻酸含量均大于限度，说明厂家对月见草油和苏子油的质量控制较好。通过方法学验证，可以看出，该方法准确、可靠，可用于测定维E三油胶丸中苏子油和月见草油的主要活性成分α-亚麻酸和γ-亚麻酸的含量。