增生型糖尿病视网膜病变患者眼玻璃体、增生膜组织LncRNA ANRIL表达及意义

陈日红,杨依玲,王宏飞,吴荣辉

(浙江新安国际医院眼科,浙江嘉兴 314000)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种眼部神经微血管病变，其主要是由糖尿病患者体内胰岛素代谢异常进而损伤患者视功能[1]。增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabrtic retinopathy，PDR)是DR患者视网膜出现新生血管，可降低患者视力功能甚至造成失明。研究表明多种炎症因子参与PDR发生及发展过程，但关于其具体发病机制尚未完全阐明[2]。现代生物技术发展迅猛，深入研究后发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)可在机体内多种生物学过程中发挥重要调控作用。研究显示部分LncRNA可参与机体视网膜组织发育及晶状体老化等过程[3]。长链非编码RNA ANRIL(long non-coding RNA ANRIL，LncRNA ANRIL)是位于细胞周期激酶抑制因子4基因座中的非编码长链RNA分子。研究表明，慢性心力衰竭患者血清LncRNA ANRIL表达水平明显升高且与患者心功能严重程度有关，并可参与心血管生成等生物学过程[4]。体外培养高糖诱导细胞研究结果发现LncRNA ANRIL表达水平升高并可调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达进而参与调节糖尿病视网膜病变过程[5]。关于LncRNA ANRIL与VEGF在PDR患者中表达变化的相关研究相对较少，因此本研究主要探讨PDR患者玻璃体及增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF表达变化，以期为临床治疗方案的制订提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2018年6月于本院进行玻璃体切割术的58例PDR患者为PDR组，且均为单侧发病，其中男26例，女32例，年龄43～70岁，平均(55.67±7.87)岁，糖尿病病程为5～15年，平均(12.34±4.31)年，根据相关标准PDR患者Ⅴ期33眼、Ⅵ期25眼[6]。同时选取同期于本院进行玻璃体切割术的35例特发性黄斑裂孔患者为对照组，所有患者均为单侧发病，其中男18例，女17例，年龄41～71岁，平均(54.26±8.21)岁。本研究经本院伦理委员会审核通过，所有患者知情且签署同意书。纳入标准：所有PDR患者均由2型糖尿病引发；出现玻璃体积血且药物治疗效果不佳；经B超检查显示视网膜前机化膜形成；未出现玻璃体积血但B超检查显示眼底出现牵拉性视网膜脱离；未接受抗新生血管药物治疗。排除标准：空腹血糖大于8 mmol/L；合并高血压等其他慢性疾病；既往眼部手术史；其他原因导致的视网膜增生等视网膜血管性疾病；合并其他眼部疾病；合并恶性肿瘤、急慢性感染及免疫系统性疾病。两组患者临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1样本采集 所有患者均接受玻璃体切割术，灌注前采用玻璃体切割头分别抽取0.6 mL玻璃体，分别置于离心管中，置于-20 ℃冰箱内保存待测。术中分别留取PDR组患者视网膜前增生膜与对照组内界膜组织，置于-80 ℃超低温冰箱保存待测。

1.2.2实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平 取冻存玻璃体或膜组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂解，采用Trizol法(北京天根生化科技有限公司)提取玻璃体或膜组织总RNA，采用紫外分光光度计检测总RNA纯度(A260/A280≥1.80)。根据反转录试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)将RNA反转录为cDNA。采用SYBR Green qPCR Master Mix(2X)试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行qRT-PCR反应。LncRNA ANRIL正向引物序列为5′-GCG CCG GAC TAG GAC TAT TT -3′，反向引物序列为5′-GCC AGG ACG GAG ATC AGA TG-3′；VEGF正向引物序列为5′-AAA CTG TCA GCT CGG TCA GA-3′，反向引物序列为5′-TCA GGG GCC GAT TAA AGC TC-3′；β-actin正向引物序列为5′-CAG CCA TGT ACG TTG CTA TCC AGG-3′，反向引物序列为5′-AGG TCC AGA CGC AGG ATG GCA TG-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)混合液10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共42个循环。采用2-ΔΔCt相对定量法计算LncRNA ANRIL、VEGF mRNA的相对表达量。7500型ABI实时荧光定量PCR仪购自上海兴曼生物科技有限公司；紫外分光光度计购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2.3Western blot检测增生膜组织中VEGF蛋白表达 RIPA蛋白裂解液(长沙达尔锋生物科技有限公司)裂解增生膜组织并提取总蛋白，12 000 r/min转速离心15 min，吸取上清液移至另一EP管内，BCA检测蛋白浓度，置于-20 ℃冰箱保存。取30 μg蛋白样品上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，结束后转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，使用脱脂奶(5%)封闭2 h，加入稀释比为1∶1 000的兔抗人VEGF抗体(上海浩然生物技术有限公司)，置于4 ℃冰箱保存过夜，次日采用PBST清洗后，加入稀释比为1∶2 000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗体(武汉艾美捷科技有限公司)，室温孵育30 min，使用ECL化学发光剂(上海生物工程股份有限公司)进行显影反应，置于Bio-Rad GelDoc EZ凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)观察蛋白条带，采用IPP6.0软件分析蛋白相对表达水平，蛋白相对表达水平=目的蛋白带A值/内参照条带A值。

1.3观察指标 采集两组患者入组时空腹静脉血5 mL放入抗凝试管中放置2 h，1 500 r/min转速离心20 min，吸取血清，应用全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)检测两组患者空腹血糖(fasting plasmaglucose，FPG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin-A1c，HbA1c)水平。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)水平，检测试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司。采用免疫透射比浊法检测C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司。

2 结 果

2.1两组患者临床资料及血清指标比较 PDR组HbA1c、FPG、TNF-α、IL-6、CRP、IL-17水平均显著高于对照组(P=0.001)，见表1。

表1 两组患者临床资料及血清指标比较

2.2两组患者玻璃体中LncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平 PDR组患者玻璃体中LncRNA ANRIL与VEGF mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者玻璃体中LncRNA ANRIL、VEGF mRNA表达水平

2.3PDR患者玻璃体中LncRNA ANRIL与VEGF的相关性分析 Pearson法分析PDR患者玻璃体中LncRNA ANRIL与VEGF的相关性，结果显示LncRNA ANRIL与VEGF呈正相关(r=0.599，P=0.001)，见图1。

图1 PDR患者玻璃体中LncRNA ANRIL与VEGF的关系

2.4两组患者增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF mRNA及蛋白表达水平比较 PDR组患者增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组(P=0.001)，见表3、图2。

表3 两组患者增生膜组织中LncRNA ANRIL、VEGF mRNA及VEGF蛋白表达水平比较

图2 两组患者增生膜组织中VEGF蛋白表达

2.5PDR患者增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF的相关性分析 Pearson法分析PDR患者增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF的相关性，结果显示LncRNA ANRIL与VEGF呈正相关(r=0.764，P=0.001)，见图3。

2.6Logistic多因素分析影响PDR发生的相关因素 将影响PDR发生的相关因素进行Logistic多因素分析，结果显示LncRNA ANRIL、VEGF均为PDR发生的影响因素，见表4。

表4 影响PDR发生因素的Logistic多因素分析

续表4 影响PDR发生因素的Logistic多因素分析

图3 PDR患者增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF的关系

3 讨 论

PDR发生与患者体内炎性反应、二酰甘油-蛋白激酶C系统活化及自由基生成等病理过程密切相关，研究表明DR患者血清VEGF水平明显升高并可反映疾病严重程度[7-8]。相关研究表明，LncRNA MIAT可通过调控mi-150-5p及其靶基因VEGF表达进而对视网膜血管内皮细胞功能发挥调节功能[9]。目前关于LncRNA与PDR发病机制的研究相对较少，因此本研究初步分析了LncRNA ANRIL与PDR发生过程的关系，为临床治疗提供新靶点。

LncRNA ANRIL位于人染色体9p21并冠状动脉粥样硬化性心脏病易感性有关[10]。研究表明LncRNA ANRIL是细胞周期激酶抑制因子4基因位点的反义长链非编码RNA，其基因多态性可影响β细胞增殖能力并降低其细胞数量代偿性，进而参与糖尿病发生过程[11]。近来研究显示，糖尿病合并脑梗死患者中LncRNA ANRIL还可通过上调VEGF表达并激活转录因子-核因子(NF-κB)信号通路，进而促进血管生成[12]。同时相关研究指出，高糖诱导的视网膜内皮细胞中LncRNA ANRIL表达水平明显升高并降低微小RNA-200b(miR-200b)表达，缓解miR-200b对其靶基因VEGF的抑制作用，进而促进视网膜病变的发生[13-14]。因此，推测LncRNA ANRIL可能通过间接调控VEGF表达进而参与PDR发生过程。本研究结果显示，PDR组患者玻璃体及视网膜前增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF相对表达水平均明显高于对照组，说明PDR患者玻璃体及视网膜前增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF表达升高，并与PDR发生过程有关。提示LncRNA ANRIL表达水平升高可促进PDR发生。

DR患者血清TNF-α、IL-6、CRP、IL-17等炎症因子水平升高并可作为临床诊断DR的重要标记物，其中TNF-α可激活Rho激酶并损伤糖尿病患者微血管，进而引发DR，血清IL-6及CRP水平升高均可引发糖尿病患者出现微血管病变[15-16]。本研究结果中PDR组HbA1c、FPG、TNF-α、IL-6、CRP、IL-17水平均显著高于对照组，说明PDR患者体内炎性反应加重并可能出现不同程度的血管病变。研究表明VEGF可通过与其受体结合改变血管通透性进而参与DR发生过程促进血管形成[17]。因此，本研究主要研究PDR患者玻璃体及增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF表达水平的相关性，结果显示PDR患者玻璃体及增生膜组织中LncRNA ANRIL与VEGF均呈正相关，说明LncRNA ANRIL可与VEGF相互作用，进而参与PDR发生过程。分析原因可能为PDR患者玻璃体及增生膜组织中LncRNA ANRIL表达水平升高可能通过降低miR-200b表达进而缓解其对VEGF的抑制作用并促使VEGF表达水平升高，高表达的LncRNA ANRIL与VEGF可参与机体炎性反应及血管生成过程，进而促进PDR发生。同时本研究Logistic多因素分析显示LncRNA ANRIL、VEGF表达水平均为PDR发生的影响因素，提示LncRNA ANRIL表达水平升高可增加PDR发生风险。

综上所述，LncRNA ANRIL在LPDR患者玻璃体及增生膜组织中呈高表达，并可能通过调控VEGF表达，进而参与PDR发生过程，为揭示PDR发生机制作铺垫，为临床治疗提供新思路。本研究存在不足之处，关于LncRNA ANRIL在PDR发生及发展过程中的具体作用机制有待进一步研究。