大蒜素联合氟康唑对假丝酵母体外抗菌活性的影响

吴秀萍 耿荣华 曲芬 郭玲玲 杨铁英

(航空总医院检验科，北京 100012)

近年来，随着临床上大量使用广谱抗菌药物、肿瘤化疗药、激素、免疫抑制剂等，临床上念珠菌感染病例越来越多，严重威胁了患者的生命健康[1]。在抗真菌药物的使用过程中，以唑类药物应用最多，尤其是氟康唑的应用最为广泛[2]，但由于其长期大量的使用，药物的副作用和耐药问题成为临床上治疗假丝酵母属感染棘手的问题。大蒜素是大蒜的球茎中提取的挥发性油状物质，具有广谱的抗微生物活性，且生物性能好、毒副作用小、临床已广泛用于抗感染治疗[3]。针对以上问题，为临床上寻找更好的抗真菌治疗方法，联合应用不同药理作用机制的抗菌药物，为减少其副作用及耐药性的研究正在展开。本研究评价氟康唑和大蒜素联合抗假丝酵母的体外活性，以期为临床抗假丝酵母的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

65株假丝酵母来自于航空总医院微生物室2015—2018年的临床送检标本，包括白色假丝酵母(Candida albicans)51株、光滑假丝酵母(Candida glabratas)8株、热带假丝酵母(Candida tropicalis)6株、其中耐氟康唑的假丝酵母有10株。质控菌株选用美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute, CLSI)推荐的白色假丝酵母标准菌株ATCC90029。

1.2 抗菌药物

大蒜素(garlicin)，规格：20mg，北京索莱宝科技有限公司，批号：110B023；氟康唑(Fluconazole),规格：1g，北京索莱宝科技有限公司，批号：504B031。

1.3 仪器与试剂

VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪，酶标仪：Sunrise；酵母样真菌鉴定卡、酵母样真菌药敏卡(微量稀释法)购于法国Bio-Merieux公司；沙保罗琼脂培养粉：购自杭州滨和有限公司；RPMI1640和小牛血清购自赛默飞世尔仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌液的配置

将待测菌从-80℃冰箱中取出，室温下融化。然后接种于沙堡罗琼脂培养基35℃下孵育24h，取单一的菌落再次转接种于沙保罗琼脂培养基中35℃孵育24h，以确保纯种和活力，挑取菌落置于3mL 0.85%的生理盐水中，利用牛鲍氏计数盘计数真菌数量，再用RPMI-1640培养基稀释，最终浓度约为2.0×103CFU/mL。

1.4.2 药液的配置

氟康唑原粉用无菌蒸馏水，配制其浓度为1280μg/mL，贮存液分装至无菌的聚丙烯小管内，于-80℃冰箱中贮存。实验时，用RPMI-1640培养液进行倍比稀释，起始浓度为128μg/mL，终末浓度为0.125μg/mL。大蒜素用RPMI-1640培养液将大蒜素配制成1024μg/mL的原液。再将原液用RPMI-1640培养液倍比稀释使大蒜素浓度为512～4μg/mL。

1.4.3 单药最低抑菌浓度的测定

最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)的操作方法按照CLSI推荐的标准(M27-A方案)微量稀释法[4]。氟康唑的药物的浓度为128～0.125μg/mL，大蒜素为512～4μg/mL)每孔加100μL于96孔板中，再加100μL含菌培养液，生长对照为100μL无药培养液加100μL菌液，阴性对照孔为无菌无药的培养液。35℃恒温培养48h，重复3次实验观察结果。酶标仪检测96孔板吸光度值(A值)，与阳性对照相比吸光度值下降50%为MIC50，与阳性对照相比吸光度值下降90%为MIC90。大蒜素、氟康唑的最低抑菌浓度MIC50，MIC90以此为判断结果。

1.4.4 棋盘法测定药物的体外抗真菌作用

体外联合药敏实验采用棋盘式微量稀释法实验(checkerboard microdilution assay)，取倍比稀释的氟康唑50μL分别加入96孔板的A～H行中，取倍比稀释的大蒜素50μL分别加入96孔板的1～8列中，药物的浓度：大蒜素512～4μg/mL，氟康唑128～0.25μg/mL。于每孔加入100μL菌液，阳性对照孔为100μL含菌培养液和100μL无药培养液，阴性对照孔为无菌无药的培养液200μL。35℃恒温培养48h，重复3次实验观察结果。

1.4.5 芽管及菌丝抑制实验

将菌株接种于沙堡弱固体培养基上，传代2次，以保证纯种和活力，挑取菌落接种于YPD培养液上，35℃恒温培养48h，获取假丝酵母的孢子。调整菌液浓度至5×107CFU/mL。取10μL的菌液加入1mL含有大蒜素，氟康唑及同时含有大蒜素和氟康唑的10%小牛血清RPMI-1640培养液中。实验分4组：a组：阴性对照组；b组：氟康唑16μg/mL；c组：大蒜素16μg/mL；d组：氟康唑0.5μg/mL+大蒜素4μg/mL。每组设4个平行管。恒温35℃培养2h，通过显微镜观察白色假丝酵母的芽管生成情况，35℃恒温培养3h时，用显微镜观察其芽孢和菌丝形成，拍照并保存图片。高倍镜下选取3～5个视野并观察100个孢子中芽管的形成个数，并计算芽管的形成率(3倍于菌体的长度为芽管)。

1.4.6 判断标准

用分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index, FICI)来判定药物联合作用效果。∑FICI=FICA+FICB=MICA联用/MICA单用+MICB联用/MICB单用。FICI≤0.5为协同作用，0.5～1为相加作用，1～2为无关作用，＞2为拮抗作用[5]。

1.4.7 统计学处理

采用SPP 17.0软件统计芽管生成率，组间比较采用t检验。b组和d组相比，c组和d组相比，芽管生成率差异显著(P＜0.01)。

2 结果

65株假丝酵母，对氟康唑敏感的有55株，对氟康唑耐药的有10株，耐药菌株包括2株白假丝酵母和7株光滑假丝酵母、1株热带假丝酵母。对氟康唑敏感的55株菌株对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑均敏感，对氟康唑耐药的菌株2株白色假丝酵母对真菌药敏试剂盒的其它4种药物均敏感，7株耐氟康唑的光滑假丝酵母和1株热带假丝酵母对真菌药敏试剂盒的4种药均耐药。

2.1 单药联合用药的MIC变化

大蒜素与氟康唑单用和联合应用对敏感和耐药假丝酵母的MIC见表1。联合用药较单一用大蒜素及氟康唑的MIC50和MIC90均有明显降低。联合用药对假丝酵母的敏感菌株和耐药菌株的MIC50氟康唑降低8倍、大蒜素降低5倍(分别为由32μg/mL降至0.25μg/mL、由32μg/mL降至2μg/mL)。

2.2 FICI值

65株菌株FICI≤0.5占100%，表现为协同作用

2.3 大蒜素作用下芽管形成率和菌丝抑制

分为4个组：分别为a组：阴性对照组；b组：氟康唑16μg/mL；c组：大蒜素16μg/mL；d组：氟康唑0.5μg/mL+大蒜素4μg/mL。b组和d组相比，c组和d组相比，芽管生成率差异显著(P＜0.01)。两药联合时，芽管生成率较单药应用时显著下降，大蒜素可以加强氟康唑的芽管抑制能力(图1)；图2显示不同药物浓度作用3h芽管形成的情况，阴性组可见大量菌丝形成，氟康唑和大蒜素组虽可见菌丝抑制，但还有一定量的菌丝生长，联合组菌丝生长明显受到抑制，说明大蒜素能加强氟康唑抑制菌丝生成的能力。

表 1 大蒜素与氟康唑联用对敏感和耐药假丝酵母MIC/(μg/mL)Tab.1 Garlicin combined with fluconazole against sensitive and resistant Candida MIC/(μg/mL)

3 讨论

图1 不同组抗生素作用3h芽管生成率 Fig.1 Germ tube formation rate after 3h of antibiotic treatment in different groups

图2 不同组抗生素作用3h显微镜下芽管形成密度Fig.2 The density of hyphae under different groups of antibiotics for 3h

近年来，深部真菌感染逐年上升，尤其以白假丝酵母感染最为多见[6]。临床上常见的抗真菌药物氟康唑存在抗菌谱窄、价格昂贵、耐药性严重及不同程度毒副作用等问题[7-8]。如何合理应用抗真菌药物并减轻其毒副作用和耐药性是临床中极具挑战性的课题。目前抗真菌药物的联合应用常局限于少数抗真菌药物之间的联合应用。中药作为祖国传统医药有着几千年的发展历史，在治疗疾病方面有着天然的优势，具有取材方便，毒副作用小的优点。本实验中的大蒜素是大蒜中的主要成分，其主要作用机制是能与含有巯基的酶相互作用，不可逆地抑制巯基蛋白酶而发挥抗菌活性[9]；大蒜素的抗细菌活性研究显示其对常见的铜绿假单胞菌有较好的抗菌作用[10]， 甚至可通过细菌体内氧化失衡而抑制多重耐药的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌，并与碳青霉烯类抗菌药物具有协同杀菌效应[11]。大蒜素应用于临床抗感染治疗也取得较好的效果，联合抗菌药物能显著提高单药的抗菌作用，有报道大蒜素联合制霉菌素治疗鹅口疮可显著提高有效率，降低复发率[12]；联合抗菌药治疗细菌感染所致呼吸机有关的肺炎时能显著缩短抗生素使用时间及ICU住院时间，降低不良反应的产生[13]。但大蒜素联合抗真菌研究很少，本研究选取了临床标本分离的白色假丝酵母、光滑假丝酵母等常见的假丝酵母菌株以微量稀释法和棋盘式微量稀释法初步确定了大蒜素抗假丝酵母和大蒜素与氟康唑联合应用的抗假丝酵母作用效果，结果显示大蒜素与氟康唑联合应用时，MIC50及MIC90均降低，证实了大蒜素可增强氟康唑的抗菌活性，具有完全协同作用。真菌作为真核细胞微生物，其有典型的细胞核，以寄生或腐生的方式生存，由单细胞或多细胞组成。多细胞类真菌主要由假丝和孢子组成，假丝形成是致病的关键因子。本研究观察氟康唑、大蒜素及两药联合抑制小牛血清诱导假丝酵母假丝及芽管的形成作用，证实大蒜素可以增强氟康唑的抑制假丝效果，假丝形成和芽管形成率均明显降低，且减少单药的用药浓度进而减少不良反应。本研究为临床的大蒜素联合抗真菌治疗提供了依据。